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文檔簡(jiǎn)介
1、背景:
戈謝病(Gaucher Disease,OMIM606463)是一種相對(duì)常見的溶酶體貯積病,呈常染色體隱性遺傳。是由于GBA基因發(fā)生突變引起溶酶體內(nèi)β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,GBA,EC3.2.1.45)活性顯著降低或缺乏而致病。β-葡萄糖苷酶的作用是將底物葡萄糖腦苷脂水解成葡萄糖和神經(jīng)酰胺,當(dāng)該酶活性降低或缺乏時(shí),大量的底物沉積于溶酶體內(nèi),造成多器官的損傷,主要表現(xiàn)為肝脾腫大、骨病和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。戈
2、謝病的臨床表現(xiàn)輕重差異較大,輕者可無癥狀,重者可在圍產(chǎn)期致死。根據(jù)神經(jīng)系統(tǒng)是否受累,戈謝病的臨床表型可分為3種:I型(非神經(jīng)型/慢性型)、II型(急性神經(jīng)型/神經(jīng)型)、III型(亞急性神經(jīng)型/神經(jīng)型)。在猶太人群戈謝病患者中,I型最為常見,各個(gè)年齡段均可發(fā)病,多在學(xué)齡前兒童發(fā)病,沒有神經(jīng)系統(tǒng)受累的表現(xiàn);II型戈謝病常在嬰兒期發(fā)病,病情嚴(yán)重,可表現(xiàn)為迅速進(jìn)展的癲癇發(fā)作、角弓反張等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,可在2歲前死亡;III型戈謝病早期表現(xiàn)為臟器的
3、損傷,后逐漸出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。戈謝病在世界各地均有發(fā)病,但其發(fā)病率具有明顯的種族差異性。據(jù)估計(jì),戈謝病在普通人群中的發(fā)病率為1/50,000-1/100,000,在猶太人群中的發(fā)病率最高,為1/500-1/1,000。
外周血白細(xì)胞或培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞GBA酶活性的檢測(cè)是診斷戈謝病的金標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)外周血白細(xì)胞或皮膚成纖維細(xì)胞中GBA酶活性明顯降低至正常均值的30%以下時(shí),即可診斷為戈謝病。隨著檢測(cè)技術(shù)的提高,以干血片為載體的GB
4、A酶學(xué)測(cè)定在戈謝病的篩查及診斷中逐漸普及應(yīng)用,為新生兒及高危戈謝病患者的篩查提供基礎(chǔ)。此外,GBA基因突變分析可從分子水平進(jìn)一步確診戈謝病。
GBA基因跨度7.6kb,位于1q21,有11個(gè)外顯子,10個(gè)內(nèi)含子,轉(zhuǎn)錄一條長(zhǎng)2387bp的mRNA,開放閱讀框?yàn)?611bp,編碼536個(gè)氨基酸的多肽鏈。在同一染色體距 GBA基因下游16kb的位置,存在一個(gè)跨度5.5kb,同源性達(dá)96%的假基因(GBAP),真假基因可發(fā)生同源重組導(dǎo)
5、致致病突變產(chǎn)生。根據(jù)人類基因突變數(shù)據(jù)庫HGMD(Professional2016.2)報(bào)道,GBA基因突變共437種,包括點(diǎn)突變、剪接突變、小缺失小插入突變、基因重排,其中以點(diǎn)突變最常見,約占75.7%。GBA基因的突變譜存在種族及地域的差異,在猶太人群及高加索人群戈謝病患者中,N370S、84GG、L444P、IVS2+1G>A這4種突變最為常見,分別占戈謝病患者GBA基因突變的97%及75%。而在亞洲人群戈謝病患者中,L444P、F
6、213I、RecNciI這3種突變最為常見。
戈謝病臨床表型與基因型間的關(guān)系尚未十分明確。N370S和N188S突變與I型戈謝病有關(guān),L444P/RecNciI基因型與II型戈謝病有關(guān),L444P純合型突變與III型戈謝病有關(guān)。戈謝病臨床表型與基因型間的關(guān)系的研究,可為患者的疾病預(yù)后評(píng)估、治療和遺傳咨詢提供幫助。
戈謝病的特異性治療方法有酶替代療法、底物減少療法、分子伴侶治療法、造血干細(xì)胞移植治療、基因治療。酶替代治
7、療是臨床采用的主要治療方法。目前,在我國(guó)上市的藥品是注射用的伊米苷酶(Imiglucerase),酶替代治療能顯著改善患者的臨床癥狀,提高患者的生活質(zhì)量,只對(duì)未涉及神經(jīng)病變的I型戈謝病有效,但不能預(yù)防或改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷,且治療費(fèi)用昂貴,普及率不高;底物減少法治療在美國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)上市的藥物有美格魯特(Miglustat, Zavesca),它是一種對(duì)I型戈謝病患者有效的口服藥,雖然可透過血腦屏障,但臨床上并沒有觀察到它對(duì)II型及III型
8、戈謝病患者有效;近幾年學(xué)者對(duì)分子伴侶治療方法的研究較多,研究發(fā)現(xiàn)分子伴侶藥物不僅能有效改善患者的臨床癥狀,而且對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀有改善作用,因?yàn)樵撍幬锟梢源┻^血腦屏障,是目前解決戈謝病神經(jīng)組織病變問題最有前景的治療方法。研究表明,針對(duì)不同的突變,分子伴侶藥物的治療效果不同,如脫氧野尻霉素類藥物可使N370S突變的GBA酶活性提高至6.2倍,而IFG類藥物可使L444P突變的GBA酶活性提高至3.5倍。因此,尋找針對(duì)不同突變的最合適的分子伴侶
9、藥物是目前戈謝病藥物治療研究的突破點(diǎn)。造血干細(xì)胞移植治療風(fēng)險(xiǎn)較大,國(guó)際上對(duì)該治療方法報(bào)道極少。基因治療仍在動(dòng)物研究階段。
對(duì)于戈謝病GBA基因突變特點(diǎn)的了解,多數(shù)來自于歐洲和美國(guó)等國(guó)外學(xué)者的文獻(xiàn)報(bào)道,除韓國(guó)和日本學(xué)者對(duì)戈謝病GBA基因突變特點(diǎn)進(jìn)行了報(bào)道,其它亞洲地區(qū)的國(guó)家對(duì)戈謝病的研究報(bào)道較少,我國(guó)對(duì)戈謝病的相關(guān)研究也非常缺乏。自1985年Sorge等成功克隆出人類GBA基因cDNA片段以來,科學(xué)家不斷深入探索了 GBA基因突
10、變對(duì)蛋白酶結(jié)構(gòu)和功能的改變及突變蛋白加工修飾過程中的異常。我國(guó)對(duì)戈謝病的分子發(fā)病致病機(jī)制的研究較晚,新突變的功能學(xué)驗(yàn)證資料更是少見。因此,分析戈謝病患者GBA基因突變特點(diǎn),對(duì)新突變致病性進(jìn)行功能學(xué)驗(yàn)證,探討戈謝病患者臨床表型與基因型間的關(guān)系是十分有意義的。
目的:
分析22例中國(guó)戈謝病患者GBA基因的突變特點(diǎn),對(duì)GBA基因新突變進(jìn)行體外功能學(xué)鑒定,并探討戈謝病臨床表型與基因型間的關(guān)系。
方法:
2
11、010年1月至2015年12月廣州市婦女兒童醫(yī)療中心內(nèi)分泌與遺傳代謝科根據(jù)外周血白細(xì)胞GBA酶活性檢測(cè)確診戈謝病患兒共22例,來自中國(guó)南方地區(qū)(廣東省、湖南省、江西省、貴州省),均無血緣關(guān)系,其中男15例,女7例。提取患者外周血基因組DNA,采用巢式PCR的方法對(duì)GBA基因的11個(gè)外顯子及外顯子兩端的側(cè)翼序列進(jìn)行基因突變分析,對(duì)新突變進(jìn)行多物種突變氨基酸的保守性分析,并利用 SIFT及 Polyphen-2軟件預(yù)測(cè)新突變的致病性,利用人
12、GBA蛋白晶體結(jié)構(gòu)同源建模,使用PyMOL及Discovery Studio軟件標(biāo)記突變位點(diǎn)在蛋白三維結(jié)構(gòu)中的位置及分析其對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響。建立GBA基因體外真核表達(dá)體系,把pcDNA3.1-EGFP作為空載體,構(gòu)建pcDNA3.1-GBA-EGFP野生型載體,然后再體外定點(diǎn)誘變成相應(yīng)的突變型載體,轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白,采用熒光法對(duì)GBA酶活性及參考酶β-半乳糖苷酶活性進(jìn)行檢測(cè),并進(jìn)行Western blot蛋白印跡分析,
13、對(duì)新突變進(jìn)行功能學(xué)驗(yàn)證。通過結(jié)合基因突變特點(diǎn)及患者臨床信息,探討戈謝病患者臨床表型與基因型間的關(guān)系。
結(jié)果:
1.本研究22例戈謝病患者的診斷年齡5個(gè)月-69歲,<3歲的患者占63.6%(13/22)。患者的外周血白細(xì)胞GBA酶活性明顯降低,為2.05±1.49 nmol/mg/h,除4例戈謝病患者的殼三糖苷酶活性為0 nmol/ml/h,其余患者的殼三糖苷酶活性均顯著升高,為5916.93±4635.75 nmol
14、/mg/h。22例戈謝病患者中,I型19例,II型3例,沒有發(fā)現(xiàn)III型患者。I型患者中,63%(12/19)的患者在2歲內(nèi)起病,且表現(xiàn)為嚴(yán)重的脾大,貧血、血小板降低等,26%(5/19)的患者3歲前死亡。II型患者均在嬰兒期發(fā)病,2歲前死亡。本研究有6例基因型為L(zhǎng)444P/L444P的I型患者,早期發(fā)病,病情嚴(yán)重;有9例基因型為L(zhǎng)444P復(fù)合雜合型的I型患者,其臨床表現(xiàn)存在輕重差異;有2例基因型均為L(zhǎng)444P/RecNciI患者,臨床
15、分型均為II型。
2.本研究的44個(gè)GBA等位基因均檢測(cè)出(檢出率為100%),共檢出18種不同的突變,包括14種已知致病突變(F37V、L96P、R120W、M123V、L264I、R359Q、Y363C、V375L、D409H、L444P、R496C、RecNciI、IVS2+1G>A、IVS6-1G>C)和4種新突變(Y22C、F109L、L149F、c.983_990delCCCACTGG)。突變L444P最常見,突變
16、率為47.7%,其次為RecNciI(6.8%)。新錯(cuò)義突變Y22C、F109L、L149F及功能未知的已報(bào)道突變L96P的突變氨基酸在12個(gè)不同物種中高度保守,且SIFT評(píng)分均接近0,Polyphen-2評(píng)分均接近1。GBA蛋白結(jié)構(gòu)分析提示 Y22C突變可使糖基化位點(diǎn) N19附近的蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;L96P、F109L、L149F突變位點(diǎn)均位于催化區(qū)域,可影響蛋白催化結(jié)構(gòu)的形成。
3.空載體、野生型及突變型載體轉(zhuǎn)染COS
17、-7細(xì)胞72小時(shí)后,熒光顯微鏡觀察可見各組細(xì)胞均顯示明亮綠色熒光,Y22C、L96P、F109L、L149F突變型載體表達(dá)GBA酶活性明顯降低。Western blot蛋白印跡分析結(jié)果提示,Y22C、L96P、F109L、L149F突變型載體GBA蛋白表達(dá)量均有不同程度的減少。
結(jié)論:
1.本研究豐富了GBA基因的突變譜。通過GBA基因分析,本研究共檢測(cè)出18種不同的突變,其中有4種新突變(Y22C、F109L、L1
18、49F、c.983_990delCCCACTGG)。L444P為熱點(diǎn)突變,突變率為47.7%,其次為RecNciI(6.8%)。
2.構(gòu)建了GBA基因體外真核表達(dá)載體,經(jīng)COS-7細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,新突變Y22C、F109L、L149F為致病性突變,同時(shí)為新突變功能學(xué)研究及分子致病機(jī)制提供基礎(chǔ)。
3.本研究發(fā)現(xiàn)L444P純合型患者與重癥的I型戈謝病有關(guān)。L444P復(fù)合雜合型患者臨床癥狀的嚴(yán)重程度常與其攜帶的另一個(gè)
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