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文檔簡介
1、DNA2是一種核酸酶/解旋酶,首先在酵母中被發(fā)現(xiàn)。作為重要的工具酶在DNA復制和修復中,參與不同的信號通路。例如在岡崎片段成熟過程中能夠去除RNA引物,雙鏈DNA斷裂修復中進行末端剪切,以及最近報道的,DNA2能夠穩(wěn)定并重新起始雞爪狀復制叉。2008年,我們實驗室首先發(fā)現(xiàn)人DNA2也具有保守的核酸酶和解旋酶結構域,但是缺少經典的核定位信號肽序列。所以免疫熒光和蛋白雜交實驗表明,人DNA2主要定位在線粒體內而非細胞核內。體外生化實驗表明,
2、人DNA2能夠移除線粒體DNA復制過程中形成的RNA引物并促進polγ合成DNA的效率。此外,人DNA2也能夠參與長片段堿基切除修復過程中翼狀結構的移除,從而穩(wěn)定極易受到氧自由基攻擊的線粒體DNA。與上述結果一致,2013年,我們與一個意大利實驗室合作共同報道,一些家族性肌無力肌病患者樣本中攜帶有幾個DNA2基因的突變位點,這些位點在氨基酸水平上都是非常保守的。我們表達并純化這些突變體,體外實驗分析發(fā)現(xiàn),它們具有核酸酶或者解旋酶缺陷。因
3、此,我們推測DNA2突變很可能直接或間接導致線粒體肌病。
本文通過基因靶向技術構建了DNA2敲除小鼠模型。結果發(fā)現(xiàn),所有的DNA2純和敲除小鼠都是胚胎致死的,說明DNA2對于胚胎發(fā)育是必須且至關重要的,但是DNA2雜合敲除是可以存活的。讓我們驚訝的是,雖然小鼠DNA2的入核信號序列也全部丟失,但是,DNA2雜合敲除小鼠表現(xiàn)出明顯的端粒復制缺陷,例如端粒丟失,端粒斷裂以及姐妹端?;ヂ?lián)等。體外實驗表明,DNA2可以特異切割由端粒特
4、殊重復序列TTAGGG形成的G4四聯(lián)體結構,并且用G4結構穩(wěn)定劑處理MEF細胞發(fā)現(xiàn),這種G4結構在DNA2雜合敲除小鼠MEF細胞中更加穩(wěn)定。此外,DNA2缺失會導致端粒損傷和染色體分離錯誤,從形成多倍體細胞。并且在DNA2雜合敲除小鼠癌癥細胞中發(fā)現(xiàn)大量功能紊亂的端粒。翻譯后修飾對于蛋白的功能調節(jié)起到重要的作用。有報道稱,酵母DNA2的磷酸化可以招募DNA2到損傷位點進行DNA修復,但是關于哺乳動物DNA2的翻譯后修飾還鮮有研究。當DNA
5、受到損傷時,修復相關的蛋白被激活并富集到損傷位點進行DNA修復。本文研究了DNA2的泛素化,數(shù)據表明,DNA2與E3連接酶相互作用并被其泛素化(多聚泛素化),泛素化后的DNA2十分穩(wěn)定不被蛋白酶體降解,并且我們推測,泛素化的DNA2能夠幫助DNA2轉運到核內進行DNA損傷修復。斑馬魚TATDN1(zTATDN1)具有內切核酸酶活性。體外生化分析,zTATDN1能夠切割雙鏈環(huán)狀DNA,形成DSB。這種生化活性使得zTATDN1能夠解離纏繞
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