MAPK在用初級精母細(xì)胞核取代生發(fā)泡的重構(gòu)卵成熟和原核形成中的調(diào)控作用.pdf

1、輔助生殖技術(shù)在治療雌雄生殖不育方面是非常有效的。卵巢刺激并結(jié)合IVF或ICSI目前已經(jīng)成為治療卵巢周期異常、輸卵管疾患、精子抗體癥、少精或無精癥方面的常用方法。但是,對于那些不能產(chǎn)生具有受孕能力配子的患者來說(如患有卵巢異?；蚵炎尤毕莸膵D女和患有精子發(fā)生失敗的男子),目前還沒有辦法獲得他們自己遺傳基因的后代,只能使用捐贈的配子或胚胎來治療。近年來,來源于克隆的一種獨(dú)特技術(shù)-體細(xì)胞單倍體化可能為那些不能產(chǎn)生配子的不育患者提供治愈的機(jī)會。體

2、細(xì)胞單倍體化是指體細(xì)胞(二倍體)被誘導(dǎo)進(jìn)入減數(shù)分裂而使二倍體的染色體形成單倍體的過程。由于哺乳動物卵母細(xì)胞能夠提供減數(shù)分裂的胞質(zhì),比較適合用來進(jìn)行體細(xì)胞單倍體化。卵母細(xì)胞在體外很容易獲得,而且近年來顯微操作技術(shù)也不斷地完善,因此體細(xì)胞單倍體化是可以發(fā)生的。但是,使用體細(xì)胞進(jìn)行單倍體化形成人工配予以及使用它正常受精的報(bào)道甚少。到目前為止,還沒有子代成功出生的報(bào)道。很多報(bào)道都顯示,體細(xì)胞在卵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)生單倍體化過程中出現(xiàn)許多異?，F(xiàn)象,如染色

3、單體不能正確地分離、細(xì)胞骨架系統(tǒng)遭到破壞、MII期染色體凝集能力較差以及蛋白激酶活性偏低等。因此,有必要對體細(xì)胞單倍體化過程中所發(fā)生的減數(shù)分裂事件進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究。 本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)、藥物處理、激光共聚焦顯微術(shù)以及蛋白激酶活性分析等方法系統(tǒng)地研究了初級精母細(xì)胞核替換生發(fā)泡(GV)后的重構(gòu)卵在體外成熟以及激活期間所發(fā)生的減數(shù)分裂事件；同時(shí),檢測了重構(gòu)卵中MAPK活性以探討重構(gòu)卵減數(shù)分裂調(diào)控的分子機(jī)理。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下；

4、 1. Gv互換重組的卵母細(xì)胞成熟率與未經(jīng)顯微操作的裸卵無差異,而且都無大極體形成,染色體100％凝集,說明我們的顯微操作系統(tǒng)對卵母細(xì)胞沒有造成傷害。 2. 初級精母細(xì)胞(PS)植入GV期卵胞質(zhì)后,能夠完成第一次減數(shù)分裂,但很多重構(gòu)卵都排出異常大的第一極體,染色體也不能完全凝集。初級精母細(xì)胞質(zhì)的量對重構(gòu)卵的成熟率、大極體形成以及染色體的凝集都沒有影響。在重構(gòu)卵成熟期間用OA處理顯著減低大極體的形成比例,提高含有完全凝集染色體卵母

5、細(xì)胞的比例；成熟期間使用U0126處理重構(gòu)卵大極體比例顯著升高,但不影響染色體凝集。 3. 重構(gòu)卵第一極體排出的速度加快,發(fā)生在注核后4.5-6.5h,比對照組裸卵和GV互換卵早4h。 4.重構(gòu)卵排出第一極體后老化40h,第一極體幾乎不發(fā)生退化,而大多數(shù)對照組裸卵和GV互換卵的極體都已退化。在成熟期間添加OA,能夠提高重構(gòu)卵第一極體的退化率,但是在激活前使用U0126處理卻不增加極體退化率。使用OA和U0126聯(lián)合處理(

6、即在成熟期聞添加OA,在激活前再添加U0126),重構(gòu)卵極體退化率與單獨(dú)使用OA組差異不顯著。說明調(diào)控極體退化的事件只發(fā)生在成熟期間,一旦極體排出,任何處理都無效。 5.重構(gòu)卵的激活率和原核形成率與GV互換組相比都顯著降低。在成熟期間添加OA或激活前添加U0126處理后,重構(gòu)卵激活率以及原核形成率顯著升高,而且兩種處理之間沒有差異。使用二者聯(lián)合處理(即先在成熟期間添加OA,然后在激活前添加U0126)后,重構(gòu)卵的激活率以及原核形

7、成率顯著高于單獨(dú)使用OA或U0126處理組。 6. 通過抗-lamina抗體染色后,核纖層蛋白在原核外周著色的強(qiáng)弱分為三種,即高度著色、中等著色和不著色。對照組裸卵和OV互換組中核纖層蛋白都發(fā)生高度著色。但是重構(gòu)卵(GV+PS)中核纖層蛋白只發(fā)生中等著色。使用OA和U0126分別在重構(gòu)卵成熟期間以及激活前處理,都能明顯提高核纖層蛋自在原核中的表達(dá),OA處理組要比U0126組效果好。使用OA和U0126組合共同處理效果更明顯。

8、 7.在MII期,重構(gòu)卵的MAPK和MPF活性都顯著低于GV互換卵。在成熟期間使用OA或U0126處理后,分別提高或降低成熟重構(gòu)卵中的MAPK活性,但對MPF活性沒有影響。說明重構(gòu)卵中大極體的產(chǎn)生、極體不發(fā)生退化及染色體完全凝集能力較差可能是由于成熟期間MAPK活性低造成的。 8.從MII期到激活前(老化12h)和激活后(原核期),GV互換卵MPF活性逐漸下降,但重構(gòu)卵中MPF活性下降幅度明顯小于OV互換卵。在成熟期間添加O

9、A或激活前使用U0126處理后,重構(gòu)卵中MPF活性沒有發(fā)生顯著變化。 9. 從MII期到激活前和激活后,GV互換卵MAPK活性逐漸下降,但重構(gòu)卵MAPK活性在此期間不發(fā)生顯著下降。應(yīng)當(dāng)指出,MII期重構(gòu)卵中MAPK活性本來就比GV互換卵低很多。成熟期間添加OA顯著提高M(jìn)II期重構(gòu)卵的MAPK活性,因此在激活前重構(gòu)卵中MAPK活性也明顯下降。在激活前使用U0126處理后,重構(gòu)卵中MAPK活性顯著下降。在成熟期間添加OA,然后在激活