人類(lèi)未成熟卵體外成熟培養(yǎng)、雌-雄原核形態(tài)學(xué)判別和原核期胚胎原核移植及其重構(gòu)胚后續(xù)發(fā)育潛能的研究.pdf

1、研究背景：自體移植是當(dāng)今最為看好的移植治療模式。自體胚胎干細(xì)胞(ESCs)的自我增殖和多向分化潛能使其成為最有潛力的自體移植供體源。但是，自體ESCs的創(chuàng)建目前還存在明顯的“低效率”問(wèn)題，原因主要是供體細(xì)胞核重新編序不完全、重構(gòu)卵細(xì)胞組分的種系特異性丟失、或缺少父源性或母源性基因印記的影響。如此，我們提出了《親緣性基因印記校正的雌核發(fā)育/雄核發(fā)育技術(shù)創(chuàng)建人自體ESCs》的全面解決方案。該方案選用自體原核作為供體細(xì)胞核源，試圖解決成體細(xì)胞

2、核基因重新編程問(wèn)題；該方案通過(guò)構(gòu)建雌核發(fā)育/雄核發(fā)育自體重構(gòu)胚，試圖解決重構(gòu)胚細(xì)胞組分缺失問(wèn)題；該方案還通過(guò)對(duì)雌核發(fā)育/雄核發(fā)育自體重構(gòu)胚進(jìn)行基因印記方面的校正處理，試圖解決基因印記缺失的問(wèn)題。本研究就該方案的實(shí)施能否使用輔助生殖臨床廢棄的未成熟卵作為(ESCs研究用)卵源、如何活體判別人類(lèi)原核的親緣性(構(gòu)建雌核發(fā)育/雄核發(fā)育方式原核期胚胎)以及相關(guān)的原核移植技術(shù)進(jìn)行了系列的前期基礎(chǔ)研究和探索。 一、卵丘冠顆粒細(xì)胞剝除的人未成熟

3、卵體外成熟培養(yǎng)和發(fā)育潛能的研究目的：1、了解卵丘冠顆粒細(xì)胞剝除的人未成熟卵(ccdIMOs)體外成熟培養(yǎng)(IVM)和相應(yīng)受精卵植入前發(fā)育潛能。2、評(píng)估同步和個(gè)體化AutoMFF-IVM(自體成熟卵泡液輔助的IVM)培養(yǎng)系統(tǒng)和AutoMFF&CCs-coIVM(自體成熟卵泡液和自體卵丘冠顆粒細(xì)胞共同輔助的IVM)培養(yǎng)系統(tǒng)分別用于M-1期(第一次減數(shù)分裂中期)和GV期(第一次減數(shù)分裂前期)ccdIMOs的IVM，相應(yīng)的IVM增進(jìn)效果。

4、 方法：1、2004年11月-2005年7月間從151對(duì)[156個(gè)卵巢刺激周期實(shí)施卵漿內(nèi)單精子注射(ICSI)治療的]不孕夫婦獲贈(zèng)388個(gè)ccdIMOs。其中GV期卵196個(gè)，M-Ⅰ期卵192個(gè)。2、IVM標(biāo)準(zhǔn)方案使用MediCultIVM系統(tǒng)(Cat＃:82214010，MediCult公司，丹麥)，微滴培養(yǎng)12～48小時(shí)(37C，5％CO2，飽和濕度)并作適當(dāng)改良，作為IVM研究的標(biāo)準(zhǔn)(對(duì)照)方案。3、AutoMFF-IVM方案系

5、在上述IVM標(biāo)準(zhǔn)方案IVM培養(yǎng)工作液內(nèi)追加10(v/v)％的AutoMFF(自體成熟卵泡液：排卵前主導(dǎo)卵泡的卵泡液)，同樣微滴培養(yǎng)，用于M-Ⅰ期ccdIMOs的IVM研究。4、AutoMFF&CCs-coIVM方案系在上述AutoMFF-IVM方案IVM培養(yǎng)工作液內(nèi)追加細(xì)胞密度在1-5×105/mL的AutoCCs(自體卵丘冠顆粒細(xì)胞)，同樣微滴培養(yǎng)，用于GV期ccdIMOs的IVM研究。5、隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，分階段(IVM、ICSI受精和

6、植入前發(fā)育)、多水平(卵核成熟和卵漿成熟)評(píng)估IVM效果。6、IVM期間，每6-12小時(shí)觀察卵核成熟情況，以第一極體(PB1)排出為卵核成熟的標(biāo)志。7、胚胎培養(yǎng)期間，每隔24h進(jìn)行一次胚胎發(fā)育抵達(dá)階段和質(zhì)量的監(jiān)測(cè)和評(píng)估。相關(guān)的ICSI受精、卵裂、植入前發(fā)育速率、質(zhì)量和囊胚形成作為IVM成熟卵卵漿成熟程度/優(yōu)劣的評(píng)估指標(biāo)。8、統(tǒng)計(jì)、分析同期自體體內(nèi)、體外成熟卵受精、卵裂和植入前胚胎發(fā)育資料，卡方(雙側(cè))檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

7、 結(jié)果：1、M-Ⅰ期ccdIMOs各個(gè)IVM時(shí)段(12h、24h、36h和48h)的累積成熟率(分別是63.5％、90.1％、91.1％和92.7％)皆明顯高于GV期ccdIMOs相應(yīng)IVM時(shí)段的成熟率(分別是0.0％、25.5％、61.7％和74.5％；P＜0.01)。2、體內(nèi)自然成熟卵的4個(gè)卵漿成熟評(píng)估指標(biāo)(ICSI受精率、卵裂率、胚胎發(fā)育第3天8細(xì)胞率和胚胎發(fā)育第3天優(yōu)質(zhì)胚胎率)分別是65.6％、96.9％、45.7％和30.

8、9％，皆明顯高于M-Ⅰ期ccdlMOsIVM成熟卵的相應(yīng)指標(biāo)(分別是50.3％、79.0％、31.3％和18.8％；P＜0.01)和GV期ccdIMOsIVM成熟卵的相應(yīng)指標(biāo)(分別是43.0％、56.4％、16.1％和0.0％；P＜0.01)。其中M-Ⅰ期ccdIMOsIVM成熟卵的2個(gè)卵漿成熟評(píng)估指標(biāo)(卵裂率和胚胎發(fā)育第3天優(yōu)質(zhì)胚胎率)皆明顯高于GV期ccdlMOsIVM成熟卵的相應(yīng)指標(biāo)(P＜0.05)。GV期ccdlMOsIVM成熟

9、卵來(lái)源的卵裂胚胎在胚胎發(fā)育第5天沒(méi)有抵達(dá)囊胚期的胚胎發(fā)育，而M1期ccdIMOsIVM成熟卵來(lái)源的卵裂胚胎有相應(yīng)5.8％的囊胚發(fā)育(P＜0.20)。3、與同一來(lái)源、同期培養(yǎng)、沒(méi)有追加AutoMFF培養(yǎng)的AutoCCs比較，追加AutoMFF培養(yǎng)的AutoCCs表現(xiàn)為可輕易辨別的明顯增大的細(xì)胞體積、明顯增多的細(xì)胞足突外延生長(zhǎng)和明顯增加的細(xì)胞匯合和培養(yǎng)液滴面積的被覆。4、M-Ⅰ期ccdIMOs使用AutoMFF-coIVM方案，其各個(gè)IVM

10、時(shí)段的累積成熟率皆高于IVM標(biāo)準(zhǔn)方案，其中在IVM24小時(shí)(96.9％vs.86.7％)和36小時(shí)(96.9％vs.88.3％)的相應(yīng)成熟率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著意義(P＜0.05)。5、GV期ccdIMOs使用AutoMFF&CCs-coIVM方案，相應(yīng)成熟率與IVM標(biāo)準(zhǔn)方案的差異在IVM36小時(shí)(68.6％vs.53.8％，P＜0.05)和48小時(shí)(85.7％vs.61.5％，P＜0.01)皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。6、GV期和M-Ⅰ

11、期ccdIMOs不同IVM方案的成熟卵，相應(yīng)卵漿成熟評(píng)估指標(biāo)皆未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著意義的差異(P＞0.05)。 結(jié)論：1、多數(shù)卵巢刺激周期獲取的ccdIMOs可經(jīng)IVM成熟。M-Ⅰ期ccdIMOs多在IVM-24小時(shí)內(nèi)成熟，而GV期ccdlMOs多在IVM-36小時(shí)內(nèi)成熟。2、與GV期ccdIMOs比較，M-Ⅰ期ccdIMOs有體外成熟快、體外成熟率高、相應(yīng)成熟卵發(fā)育潛能較好的特點(diǎn)，將優(yōu)先推薦作為臨床輔助生育或ESCs研發(fā)的自體

12、或捐贈(zèng)卵源。3、培養(yǎng)基內(nèi)追加AutoMFF可促進(jìn)AutoCCs飼養(yǎng)層樣生長(zhǎng)和增殖。4、本研究開(kāi)發(fā)的同步和個(gè)體化AutoMFF-IVM和AutoMFF&CCs-coIVM系統(tǒng)分別用于M-Ⅰ期和GV期ccdIMOs的IVM，可以明顯促進(jìn)和改善相應(yīng)期別ccdIMOs的卵核成熟；但是對(duì)成熟卵其后的受精和植入前胚胎發(fā)育潛能的促進(jìn)和改善作用有限，需要進(jìn)一步優(yōu)化。 二、人類(lèi)原核形態(tài)學(xué)特征的親緣學(xué)意義及其驗(yàn)證研究目的：1、提出人兩性生殖原核期胚

13、胎原核親緣性活體判別形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的推薦方案。2、設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)相應(yīng)可信、可行的活體驗(yàn)證方法。3、驗(yàn)證相應(yīng)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)在人原核親緣性預(yù)測(cè)方面的準(zhǔn)確性。 方法：1、依據(jù)人原核發(fā)育生物學(xué)的相關(guān)原理和非靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物相關(guān)的零星報(bào)道，提出人兩性生殖原核期胚胎原核親緣性活體判別形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的推薦方案。2、設(shè)計(jì)并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)的人卵漿內(nèi)雙精子注射(2Sperm-ICSI)受精兩性生殖方式三原核胚胎模型(2個(gè)雄原核、1個(gè)雌原核，卵周隙內(nèi)2個(gè)極體)，用于推薦的人原核

14、親緣性活體判別形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的驗(yàn)證研究。構(gòu)建模型所需的89個(gè)人成熟卵和68份正常精子懸液分別來(lái)自捐贈(zèng)的108個(gè)(卵巢刺激周期卵丘冠顆粒細(xì)胞剝除的)未成熟卵(ccdIMOs)的體外成熟培養(yǎng)(IVM)和同期68例非男性因素不孕夫婦的捐贈(zèng)。3、依據(jù)人2Sperm-ICSI受精兩性生殖方式三原核胚胎模型的3個(gè)原核相對(duì)確認(rèn)的親緣性(2個(gè)雄原核——形態(tài)/大小相互匹配/一致、又相對(duì)遠(yuǎn)離第二極體；1個(gè)雌原核—單獨(dú)的、與其它原核形態(tài)/大小不匹配/不一致、又相

15、對(duì)接近第二極體)，先相對(duì)確認(rèn)該三原核胚胎模型原核的親緣性，再驗(yàn)證推薦的原核親緣性活體判別形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)相應(yīng)判別準(zhǔn)確性。 結(jié)論：1、人2Sperm-ICSI受精兩性生殖方式三原核胚胎模型用于人原核親緣性活體判別形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的驗(yàn)證研究，簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、可行、有效、新穎，是相關(guān)領(lǐng)域值得推薦的研究方法。2、推薦的人兩性生殖方式原核期胚胎原核親緣性活體判別的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)是兩性生殖原核期胚胎中相對(duì)較大且距PB2相對(duì)較遠(yuǎn)者為雄原核；反之，相對(duì)較小且距PB

16、2相對(duì)較近者為雌原核。該形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)明顯的活體判別效果和自然優(yōu)勢(shì)，是相關(guān)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用領(lǐng)域簡(jiǎn)便、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)、可行的參照標(biāo)準(zhǔn)和操作規(guī)范。 三、人類(lèi)原核期胚胎原核移植操作及其重構(gòu)胚后續(xù)發(fā)育潛能的研究目的：1、設(shè)計(jì)/開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)易、自然、可行、效好的原核移植方式。2、評(píng)估相應(yīng)原核移植重構(gòu)胚后續(xù)植入前發(fā)育潛能。 方法：1、2004年11月-2005年7月間共獲得34例不孕婦女(34個(gè)IVF-ET治療周期；平均年齡29.7±4.2歲)

17、捐贈(zèng)的人原核期胚胎54個(gè)。2、其中20個(gè)多原核胚胎實(shí)施人原核從原核期胚胎移出的顯微操作(選擇性原核減滅術(shù)—SPnR組)，使受術(shù)胚胎變?yōu)榇?雄原核各一的正常兩性生殖原核期胚胎。SPnR原核親緣性活體判別和選擇的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)是兩性生殖方式原核期胚胎中相對(duì)較大且距PB2相對(duì)較遠(yuǎn)者為雄原核；反之，相對(duì)較小且距PB2相對(duì)較近者為雌原核。3、另23個(gè)同期同來(lái)源的多原核胚胎不實(shí)施SPnR操作，作為SPnR處理的自然對(duì)照(對(duì)照組)。4、其余11個(gè)原核期胚

18、胎分為6組，每組2個(gè)胚胎，分別作為受體胚胎和供體胚胎，實(shí)施原核移植。其中1組1個(gè)胚胎實(shí)施自體的原核移植。具體原核移植過(guò)程包括在受體胚胎先實(shí)施的SPnR(使成為單原核胚胎)、再自供體胚胎取出(SPnR方式)供體原核、最后將供體原核植入(卵漿內(nèi)原核直接注射——ICPI方式)單原核狀態(tài)的受體胚胎(恢復(fù)其雙原核構(gòu)成)。5、所有原核期胚胎，不管受術(shù)與否，常規(guī)體外囊胚培養(yǎng)。6、統(tǒng)計(jì)、分析、比較手術(shù)時(shí)程、手術(shù)成功率、胚胎存活/卵裂率、胚胎發(fā)育速率和質(zhì)