MBP原核表達(dá)及其對(duì)樹突狀細(xì)胞表型和功能成熟的影響.pdf

1、背景和目的
　　麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding protein，MBP)是近年發(fā)現(xiàn)的免疫佐劑，它可提高重組亞單位疫苗的免疫原性。研究發(fā)現(xiàn)，MBP具有廣泛的免疫活性，可激活NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和Th1細(xì)胞;也可通過TLR4活化DC，產(chǎn)生前炎癥因子參與免疫。由此提示MBP可作為免疫增強(qiáng)劑，單獨(dú)作用時(shí)也可提高機(jī)體免疫應(yīng)答。
　　DC是功能最強(qiáng)的專職性抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC

2、)，是唯一能直接激活初始T細(xì)胞的專職性APC，在固有免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮著重要的作用。DC的發(fā)育分為成熟與未成熟階段，兩者具有不同的生物學(xué)特征和細(xì)胞表型。非成熟DC低表達(dá)MHC分子和CD40、CD54、CD80、CD86等共刺激分子和粘附分子;成熟的DC高表達(dá)CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD40等共刺激分子，和細(xì)胞間粘附分子ICAM-1(CD54)等。
　　迄今，有關(guān)MBP的研究，主要集中在研究MBP融合重組蛋

3、白的活性。然而關(guān)于MBP直接作用于免疫系統(tǒng)，并提高疫苗免疫應(yīng)答反應(yīng)的機(jī)制還不清楚。所以，本課題通過構(gòu)建MBP原核表達(dá)載體，表達(dá)并分離純化MBP，在此基礎(chǔ)上，研究MBP對(duì)DC分化和功能成熟的影響。旨在為闡明MBP作為新型免疫增強(qiáng)劑的分子機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為疫苗佐劑的研究提供新的線索。
　　方法
　　1.構(gòu)建MBP原核表達(dá)系統(tǒng):以大腸桿菌K12 DNA為模板，PCR擴(kuò)增malE基因并構(gòu)建其原核表達(dá)系統(tǒng)。采用SDS-PAGE檢

4、測(cè)目的蛋白MBP表達(dá)情況，AmyloseResin柱提純MBP。Western Blot鑒定MBP的免疫反應(yīng)性。
　　2.DC2.4細(xì)胞系的培養(yǎng):DC2.4培養(yǎng)于含10％ FCS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含300 mg/L谷氨酰胺，100 U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素）。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)分為3組，1）空白對(duì)照組;2）1μg/ml MBP組;3）5μg/ml MBP組。收集DC2.4細(xì)胞，各組分別用以下

5、方式處理:1）空白對(duì)照組，即DC2.4組;2) DC2.4+1μg/ml MBP;3）DC2.4+5μg/ml MBP。然后將24孔板放入37℃、含5％ CO2的孵箱中培養(yǎng)10h。收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清，分別用于DC表型和細(xì)胞因子濃度檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　4.DC2.4表型變化的檢測(cè):流式細(xì)胞術(shù)分析DC表面分子CD40、CD54、CD80、CD86、MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ表達(dá)。
　　5.細(xì)胞因子檢測(cè):ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中

6、細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-12及IL-23的濃度。
　　結(jié)果
　　1.所克隆的matE基因DNA序列與文獻(xiàn)報(bào)道完全相同。所構(gòu)建的原核表達(dá)系統(tǒng)能成功表達(dá)MBP蛋白。Western Blot鑒定后確為MBP蛋白。
　　2.MBP可刺激DCs表面分子CD40、CD54、CD80、CD86、MHC-Ⅰ分子表達(dá)，MHC-Ⅱ分子的表達(dá)略有下降。
　　未處理組DC2.4表面CD40、CD54、CD80、CD86、MH

7、C-Ⅰ及MHC-Ⅱ的相對(duì)平均熒光強(qiáng)度(△MFI)分別為23.45±1.68、335.15±6.55、3.54±0.36、60.75±4.18、250.15±5.43和64.35±6.02; DC2.4與1μg/mL MBP共培養(yǎng)之后，△MFI分別為35.65±1.30、412.15±10.27、5.45±0.20、145.15±6.55、343.15±13.21和43.05±4.15;DC2.4與5μg/mL MBP共培養(yǎng)之后，△MFI

8、分別為31.45±1.95、410.15±4.52、5.51±0.20、150.15±7.01、391.15±6.66和25.05±4.42。與未處理組相比，MBP處理組DC2.4表面共刺激分子CD40、CD54、CD80、CD86和MHC-Ⅰ分子表達(dá)增加，MHCⅡ分子的表達(dá)下降。
　　3.MBP增強(qiáng)DCs分泌IL-23，但對(duì)IL-1β、IL-6和IL-12的表達(dá)無顯著影響。
　　未處理組DC2.4培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-

9、1β、IL-6、IL-12和IL-23的含量分別為(pg/mL):1025.50±35.36、311.9±27.02、18.4±1.15和2.3±2.08;1μg/mL MBP處理后，培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-1β、 IL-6、IL-12和IL-23的含量分別為(pg/mL):937.00±53.03、332.8±1.09、16.5±0.86和26.4±2.08;5μg/mL MBP處理后，培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、 I