CCK-8對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞表型和功能成熟的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制.pdf

1、我們前期的研究表明，CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞p38 MAPK-NF-κB通路具有抑制性調(diào)節(jié)作用，但CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)的DC成熟過(guò)程及其相關(guān)的MAPK-NF-κB信號(hào)通路是否有調(diào)節(jié)作用，均未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的小鼠骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞(BM-DC)為對(duì)象，系統(tǒng)研究CCK-8對(duì)LPS作用下細(xì)胞內(nèi)MAPK-IκB-NF-κB-DC表型和功能變化這條通路的影響，探討CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)DC成熟過(guò)程及其信號(hào)通路的影響，

2、以進(jìn)一步揭示CCK-8免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。 1.CCK受體在樹(shù)突狀細(xì)胞的表達(dá) 骨髓細(xì)胞自C57BL/6小鼠股骨和脛骨骨髓中分離，在含有GM-CSF的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。收集懸浮和疏松貼壁細(xì)胞，然后用免疫磁珠分選純化，獲得iDC，并用流式細(xì)胞術(shù)鑒定其純度。分選后的細(xì)胞分別加入一抗山羊抗CCK-1R/2R抗體，二抗FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG，最后置于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，同時(shí)以僅孵育二抗FITC-IgG的細(xì)胞作為同型對(duì)照?；?/p>

3、者分選后的細(xì)胞均勻涂于載玻片，4％多聚甲醛固定后，分別加入一抗山羊抗CCK-1R/2R抗體，二抗FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG，另采用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。最后甘油封片后于熒光顯微鏡下觀察并照相。結(jié)果顯示：(1)細(xì)胞培養(yǎng)7d分選后，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定BM-DC純度在90％以上。(2)經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和熒光顯微鏡觀察證實(shí)CCK-1R和CCK-2R在BM-DC細(xì)胞中均有表達(dá)。該結(jié)果為CCK-8對(duì)生理及病理?xiàng)l件下DC發(fā)揮調(diào)節(jié)作用提供了直接的結(jié)

4、構(gòu)依據(jù)，為進(jìn)一步完善CCK-8的免疫調(diào)節(jié)功能提供了基礎(chǔ)。 2.CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的影響 LPS誘導(dǎo)DC成熟過(guò)程中伴隨細(xì)胞表型和功能的改變，本研究觀察CCK-8對(duì)LPS活化DC過(guò)程中細(xì)胞表型(CD80、CD86、MHCII表達(dá))及功能(吞噬功能、分泌細(xì)胞因子及協(xié)同刺激能力)的影響。分選純化后的iDC，分為八組：control組；LPS組；LPS+CCK-8(10-10、10-8、10-6mol·L-1)組

5、；CR1409組即LPS+CCK-8(10-8mol·L-1)+CR1409(10-6mol·L-1)組；CR2945組即LPS+CCK-8(10-8mol·L-1)+CR2945(10-6mol·L-1)組；CCK-8(10-8mol·L-1)組。 收集不同因素作用后的各組細(xì)胞，分別加入熒光標(biāo)記的抗CD80、抗CD86和抗MHCⅡ的抗體，孵育30min，采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面CD80、CD86和MHCⅡ含量的變化。各組細(xì)胞

6、均加入FITC-dextran作用1h后，收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞吞噬能力的變化。用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12p40、IL-12p70、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。用免疫磁珠分選法從BALB/c小鼠脾細(xì)胞分離CD4+T細(xì)胞，按10:1數(shù)量比與上述各組樹(shù)突狀細(xì)胞共同體外培養(yǎng)72h，采用MTT法測(cè)定CD4+T細(xì)胞增殖程度以反映樹(shù)突細(xì)胞的協(xié)同刺激活性。數(shù)據(jù)用-x±s表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，

7、各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(least significant difference，LSD)作兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。 結(jié)果表明CCK-8除協(xié)同LPS誘導(dǎo)DC分泌IL-12外，對(duì)LPS誘導(dǎo)DC表型和功能的成熟具有抑制性調(diào)節(jié)作用。 3.CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞MAPK活性的影響 MAPK是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白網(wǎng)絡(luò)中重要的成員，已知MAPK亞家族成員ERK、p38m

8、APK和JNK參與了LPS誘導(dǎo)DC成熟過(guò)程的調(diào)控。結(jié)合前部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本部分將主要觀察CCK-8對(duì)LPS活化的DC細(xì)胞中p38MAPK、JNK1/2、ERK1/2活性的影響，旨在進(jìn)一步明確CCK-8對(duì)LPS作用下DC活性和功能改變的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。分選純化的iDC在不同刺激因素作用后(分組同前)，提取細(xì)胞胞漿蛋白，用Western blot技術(shù)分析胞漿中p38MAPK、JNK1/2、ERK1/2蛋白的活化水平。數(shù)據(jù)用-x±s表示，用S

9、PSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(least significant difference，LSD)作兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。 結(jié)果表明，CCK-8協(xié)同LPS誘導(dǎo)DC細(xì)胞p38mAPK的磷酸化，降低了LPS對(duì)DC細(xì)胞JNK活化的誘導(dǎo)作用，對(duì)LPS誘導(dǎo)ERK通路的活化無(wú)明顯影響。提示，CCK-8抑制LPS誘導(dǎo)DC表型和功能成熟而協(xié)同LPS促進(jìn)IL-12分泌

10、，可能與其對(duì)MAPK通路調(diào)節(jié)的多樣性有關(guān)，同時(shí)也提示CCK-8可能對(duì)MAPK之外的其它信號(hào)通路有調(diào)控作用。 4 CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞NF-kB活性的影響 前一部分已證實(shí)CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)DC細(xì)胞中MAPK通路的活化具有調(diào)節(jié)作用，NF-κB是MAPK下游的轉(zhuǎn)錄因子之一，并且已有研究表明NF-κB通路在LPS誘導(dǎo)DC成熟過(guò)程中起重要作用。因此，本部分主要觀察CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞NF-κB活性及I

11、κB蛋白表達(dá)水平變化的影響。分選純化的DC在不同刺激因素作用后(分組同前)，提取細(xì)胞胞核蛋白，用EMSA技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞NF-κB活性；提取細(xì)胞胞漿蛋白，用Western blot技術(shù)分析胞漿中IκB蛋白的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)用-x±s表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(least significant difference，LSD)作兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。

12、 結(jié)果表明，CCK-8可抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB活性，其上游信號(hào)機(jī)制為通過(guò)CCK受體介導(dǎo)而抑制IκB蛋白磷酸化。 結(jié)論: 本研究首次系統(tǒng)研究了CCK-8對(duì)LPS作用下小鼠骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表型和功能成熟的影響，并從受體、蛋白激酶、核轉(zhuǎn)錄因子多個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行了探討，結(jié)論如下： 1.小鼠骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表面存在兩種CCK受體亞型：CCK-1R和CCK-2R。為進(jìn)一步研究CCK-8對(duì)DC調(diào)

13、節(jié)作用提供了基礎(chǔ)。 2.CCK-8可抑制LPS誘導(dǎo)的DC成熟、促炎癥細(xì)胞因子的分泌以及促T細(xì)胞增殖的能力，并可促進(jìn)IL-12的分泌。表明CCK-8對(duì)DC有雙向調(diào)節(jié)作用，提示CCK-8可能通過(guò)調(diào)控DC分化成熟，進(jìn)而成為一些與DC過(guò)度活化有關(guān)的自身免疫性疾病的潛在治療因子。 3.CCK-8促進(jìn)LPS誘導(dǎo)IL-12分泌增加可能與其促進(jìn)p38 MAPK活化，抑制JNK活化有關(guān)。 4 CCK-8抑制LPS誘導(dǎo)的DC成熟是通

14、過(guò)抑制NF-κB活性實(shí)現(xiàn)的。 本研究首次證實(shí)CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)DC分泌IL-12具有促進(jìn)作用，對(duì)LPS誘導(dǎo)DC表型和其它功能方面的成熟具有抑制性調(diào)節(jié)作用，該機(jī)制可能與CCK-8通過(guò)CCK-1R、CCK-2R介導(dǎo)對(duì)MAPK-NF-κB這條信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)作用有關(guān)。提示對(duì)于存在DC過(guò)度活化的一些自身免疫性疾病的治療中，CCK-8可能是一種潛在的有效治療因子。但DC成熟的不同階段和具體成熟過(guò)程是被復(fù)雜而精確的調(diào)控著，其中可能伴隨多