BDDE交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠修飾度的測定.pdf

1、透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)是由β-D-葡萄糖醛酸(GlcA)和β-N-乙酰氨基葡萄糖(Gl cNAc)雙糖單位通過交替的(1→4)和(1→3)糖苷鍵連接而成的天然高分子酸性粘多糖。由于良好的生物相容性和獨(dú)特的理化性質(zhì)，HA目前被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥及美容領(lǐng)域，交聯(lián)HA凝膠作為一種新型安全有效的皮下填充材料，已被廣大愛美人士和臨床醫(yī)生接受。
　　天然HA由于易被體內(nèi)的透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase，HAase

2、)降解，在體內(nèi)保留時間較短，大大限制了HA的臨床應(yīng)用。為了克服HA易被體內(nèi)HAase降解的不足，提高凝膠的粘彈性，天然HA通常通過交聯(lián)劑對其進(jìn)行化學(xué)修飾得到交聯(lián)HA凝膠。修飾度指HA分子被交聯(lián)劑修飾的程度，作為交聯(lián)HA凝膠的重要性質(zhì)參數(shù)，修飾度從化學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上直接決定凝膠的多種性質(zhì)，如吸水膨脹性、粘彈性、體內(nèi)半衰期等。因此探索可靠的修飾度測定方法，為研究交聯(lián)HA凝膠的制備工藝和保證其應(yīng)用安全性有著重要意義。
　　本課題以1，4-丁

3、二醇縮水甘油醚(BDDE，1，4-butanediol diglycidyl ether)為交聯(lián)劑制備交聯(lián)HA凝膠，提出與修飾度相關(guān)的三個交聯(lián)參數(shù)總修飾度(t-MOD)、懸掛修飾度(p-MOD)和交聯(lián)修飾度(c-MOD)，并探索了三個交聯(lián)參數(shù)的測定方法。
　　1.交聯(lián)HA凝膠的制備
　　以BDDE為交聯(lián)劑，控制交聯(lián)劑的加入量制備了不同修飾度的交聯(lián)HA凝膠，通過1H-NMR對交聯(lián)HA凝膠進(jìn)行了化學(xué)表征;對不同修飾度的HA凝膠的

4、粘彈性、膨脹系數(shù)進(jìn)行了考察;通過掃描電鏡SEM對HA凝膠的表面形態(tài)進(jìn)行了表征;利用GC法分析了BDDE在堿液中穩(wěn)定性。
　　2.交聯(lián)HA凝膠的酶解研究
　　用一種來源于芽孢桿菌的透明質(zhì)酸裂解酶HAase-B(能夠徹底降解HA為不飽和雙糖ΔDiHA)對交聯(lián)HA凝膠進(jìn)行了徹底的酶解，采用分子排阻色譜法對交聯(lián)HA凝膠酶解產(chǎn)物進(jìn)行了分離制備，并通過1H-NMR和MS對酶解產(chǎn)物進(jìn)行了定性分析。結(jié)果顯示，交聯(lián)HA凝膠的酶解產(chǎn)物中含有五個

5、有BDDE分子鏈接的寡糖片段，即修飾片段。
　　3.交聯(lián)HA凝膠修飾度的測定
　　根據(jù)面積歸一化法，總的修飾度t-MOD由分子排阻色譜圖中修飾片段的峰面積計算得到;通過SEC-MS分析，懸掛修飾度(p-MOD)和交聯(lián)修飾度(c-MOD)由總離子流色譜圖(TIC)中懸掛修飾和交聯(lián)修飾片段的離子峰面積占比計算得到。
　　4.上市產(chǎn)品的修飾度分析
　　利用上述方法對已上市交聯(lián)HA凝膠產(chǎn)品的修飾度進(jìn)行了測定，通過對比不同