全細胞催化生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的條件優(yōu)化及微生物發(fā)酵生產(chǎn)聚唾液酸的研究.pdf

1、N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-Acetylneuraminic Acid，Neu5Ac)具有多樣的生物學功能，其在治療流感、神經(jīng)性疾病、炎癥和腫瘤等方面具有重要的醫(yī)藥價值，特別是在流感（包括禽流感H5N1和2009年的H1N1）的預防和治療方面有良好的效果。Neu5Ac現(xiàn)有的生產(chǎn)方法產(chǎn)量低，成本高，難以滿足醫(yī)藥工業(yè)大規(guī)模的需求，因而急需建立一種經(jīng)濟高效的生產(chǎn)方法。在Lin BX的前期研究中，構(gòu)建了一株產(chǎn)Neu5Ac的代謝工程菌（E.coli△n

2、anTEK/pNA），本研究通過對工程菌細胞培養(yǎng)和全細胞生物轉(zhuǎn)化的各種條件的摸索，對工程菌生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)Neu5Ac的過程進行優(yōu)化。經(jīng)過條件優(yōu)化，建立了全細胞催化法生產(chǎn)Neu5Ac的小試工藝流程，使Neu5Ac的產(chǎn)量提高到294.39 mM，該方法具有操作簡便、高效和經(jīng)濟的優(yōu)勢，為Neu5Ac的規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 在生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)部分丙酮酸用于細胞的新陳代謝，通過基因敲除技術(shù)敲除ldhA，poxB，aceE，plfB，m

3、eaB等基因，減弱丙酮酸的旁路代謝途徑，使丙酮酸主要用于合成Neu5Ac，以確保獲得Neu5Ac的高生產(chǎn)強度。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)敲除ldhA和plfB基因的突變株對丙酮酸的旁路代謝途徑有一定的減弱效果，但并不顯著。采用P1噬菌體轉(zhuǎn)染整合E.coli△plfB和E.coli△ldhA的性狀，構(gòu)建敲除株E.coli△BA。以0.2 M丙酮酸和0.8 M G(l)cNAc為底物進行生物轉(zhuǎn)化，結(jié)果顯示丙酮酸用于代謝旁路的量降低了24.96％，同時Neu

4、5Ac的產(chǎn)量隨之提高了7.11％。
　　 聚唾液酸(Polysialic acid，PSA)是唾液酸單體以α-2，8或α-2，9糖苷鍵連接而成的聚合物。聚唾液酸具備良好的非免疫原性，生物相容性和可降解性，是理想的藥物緩釋劑和醫(yī)用支架材料。此外，聚唾液酸經(jīng)水解可得到一系列的唾液酸類物質(zhì)，這些衍生物多可應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和保健品等領(lǐng)域的高附加值產(chǎn)品。目前，微生物發(fā)酵是獲得聚唾液酸的唯一生產(chǎn)方法。E.coli SA8自身可產(chǎn)生聚唾液酸，

5、以E.coli SA8基因組為模板，克隆CMP-Neu5Ac合成酶，優(yōu)化乙?；D(zhuǎn)移酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的密碼子，構(gòu)建系列表達載體再轉(zhuǎn)入E.coliSA9中進行過表達，以加強唾液酸到聚唾液酸這一合成途徑。將經(jīng)改造后的重組菌接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，最高獲得約0.97 mg/mL的聚唾液酸，產(chǎn)量比出發(fā)菌株E.coli SA9提高了約150％，說明通過本方法可以達到加強PSA合成途徑的目的，并證明了乙酰基轉(zhuǎn)移酶為PSA合成途徑中的限速酶。