N-乙酰神經(jīng)氨酸特異性生物傳感器的構(gòu)建及生產(chǎn)菌株優(yōu)化.pdf

1、N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid，NeuAc)及其衍生物參與許多生理和病理過程，在食品、藥品和保健品行業(yè)都有極大的應(yīng)用潛力。傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物提取法過程繁瑣、效率低下，難以滿足市場需求?，F(xiàn)階段，酶法合成和全細(xì)胞生物催化是生產(chǎn)NeuAc的主要途徑。但這兩種方法都需要添加丙酮酸和GlcNAc作為前體物，價格比較昂貴。
　　利用葡萄糖或其它廉價碳源直接發(fā)酵生產(chǎn)NeuAc十分具有吸引力，因?yàn)樵撨^程可以一步合成N

2、euAc而不需要添加任何直接前體物。前期實(shí)驗(yàn)中，在大腸桿菌中構(gòu)建了一條葡萄糖起始的NeuAc合成途徑(DN5/pNnsGM)。菌株發(fā)酵時中間產(chǎn)物GlcNAc大量積累，ManNAc和丙酮酸也有一定量積累。通過在發(fā)酵過程中外源添加丙酮酸，NeuAc產(chǎn)量提高了104.6％，這說明相對于ManNAc來說，丙酮酸是不足的。于是本論文在一株實(shí)驗(yàn)室已有的丙酮酸高產(chǎn)菌株中表達(dá)了NeuAc合成途徑，但未能實(shí)現(xiàn)NeuAc積累;本論文嘗試在DN5中過表達(dá)gl

3、k增加丙酮酸供給，結(jié)果影響不大。
　　接下來，本論文以大腸桿菌K1來源的NeuAc合酶neuB替換掉pNnsGM中的nanA，希望通過最后一步反應(yīng)的單向性增加產(chǎn)物合成。DN5/pB發(fā)酵積累1.75g/L NeuAc，較DN5/pNnsGM提高了1.55倍，中間產(chǎn)物GlcNAc和ManNAc濃度提高了一倍多，而丙酮酸的濃度降低。為降低乙酸積累，本論文在DN5基礎(chǔ)上敲除了磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因pta得到DN6菌株，發(fā)酵DN6/pB時，乙酸

4、積累由4.62g/L減少到1.55g/L。
　　為提高細(xì)胞內(nèi)PEP的水平，本論文在DN6基礎(chǔ)上敲除了葡萄糖專一性的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中膜整合蛋白ⅡCBGlc編碼基因(ptsG)構(gòu)建了DN7菌株以阻斷PTS系統(tǒng)，減少PEP消耗。DN7/pB發(fā)酵48h積累1.48g/L NeuAc，較DN5/pB緩慢;中間產(chǎn)物ManNAc濃度稍高(2.63vs.1.17g/L)，沒有檢測到丙酮酸。
　　隨后本論文敲除了編碼PEP羧化酶的ppc基因，

5、得到重組菌株DN8。DN8/pB發(fā)酵70h積累2.0g/L NeuAc，葡萄糖消耗速率僅為0.26g/L/h，生物量積累明顯受到影響。這可能是因?yàn)閜pc編碼的PEP羧化酶是大腸桿菌C4回補(bǔ)途徑的重要一環(huán)，它不可逆地催化PEP與二氧化碳反應(yīng)生成草酰乙酸，回補(bǔ)TCA循環(huán)。因此該基因的缺失一定程度上影響了菌體生理，使得糖耗減慢。
　　本論文在1L罐上對DN8/pB進(jìn)行了發(fā)酵優(yōu)化，最終在37℃、高溶氧條件下(4vvm)，發(fā)酵52h積累Ne

6、uAc4.15g/L。但在5L罐發(fā)酵時菌株生長很差、產(chǎn)量很低，說明發(fā)酵條件需要進(jìn)一步優(yōu)化。
　　微生物利用簡單底物生產(chǎn)小分子化合物的能力是十分驚人的，但是由于生理代謝的復(fù)雜性，理性改造常常收效甚微。從這個意義上，隨機(jī)突變加高通量篩選策略有其獨(dú)特優(yōu)勢。但是，突變體的表征卻成為新的限制性因素，因?yàn)楹铣傻拇蠖鄶?shù)小分子不會賦予生產(chǎn)菌株易于篩選的表型。生物傳感器的應(yīng)用在很大程度上解決了這一問題。它們能夠感應(yīng)胞內(nèi)代謝物的濃度變化，并通過報(bào)告基

7、因以熒光、酶活或者偶聯(lián)細(xì)胞生長的方式起到高通量篩選的作用，對微生物代謝途徑改造和菌株進(jìn)化研究意義重大。2013年，Cho等人利用SELEX方法篩選到了NeuAc特異性的RNA適配子，為NeuAc生物傳感器的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
　　通過將該適配體酶與組成型強(qiáng)啟動子PJ23106、緩沖序列、報(bào)告基因相連，本論文構(gòu)建了NeuAc特異性的RNA傳感器。當(dāng)胞內(nèi)NeuAc結(jié)合在RNA適配子之后引起整個開關(guān)的構(gòu)象變化，導(dǎo)致錘頭型核酶發(fā)生自剪切，產(chǎn)

8、生一個缺口，暴露出新的5’羥基并在大腸桿菌內(nèi)源RNase J1核酸酶的作用下，由5’→3’方向?qū)RNA進(jìn)行剪切，從而降低下游報(bào)告基因的豐度。
　　以sfgfp為報(bào)告基因時，12mM的外源NeuAc造成高達(dá)11.8倍的熒光抑制，證明外源添加NeuAc的量可以與報(bào)告基因gfp的表達(dá)偶聯(lián)。之后本論文用tetA代替gfp建立了基于Ni2+的高通量篩選系統(tǒng)。TetA編碼一個四環(huán)素/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并且可以用作雙向篩選標(biāo)記。TetA的表達(dá)賦予細(xì)

9、胞四環(huán)素抗性，同時使細(xì)胞對毒性金屬離子如NiCl2更敏感。細(xì)胞內(nèi)NeuAc濃度的增加將激活適配體酶的自剪切進(jìn)而降低TetA的表達(dá)，減少Ni2+的泵入，因此具有更高胞內(nèi)NeuAc濃度的細(xì)胞在NiCl2條件下更具有生長優(yōu)勢。
　　為了使培養(yǎng)基的干擾最小化，本論文采用了成分較為簡單的M9B基本培養(yǎng)基。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，本論文確定了該培養(yǎng)基中Ni2+的最佳篩選濃度為50μM，在該濃度下，TetA過表達(dá)造成的生長抑制最明顯。在0-86.4±5.1

10、mg/g cdw胞內(nèi)NeuAc范圍內(nèi)，50μM Ni2+條件下，細(xì)菌生長與胞內(nèi)NeuAc濃度成正比。本論文還發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的NeuAc傳感器在乳酸菌中同樣有活性，在0-25.6mM外源NeuAc范圍內(nèi)，傳感器工作良好，這也說明在不同的物種間核酶的工作機(jī)制十分相似，暗示基于RNA的傳感器可能具有更好的種間適應(yīng)性。
　　隨后本論文進(jìn)行了模擬篩選以驗(yàn)證篩選系統(tǒng)的可用性。本論文構(gòu)建了NeuAc高產(chǎn)菌株DN5/pB與原始菌株DN5/pNnsGM

11、(1∶100)混合的模型文庫。在篩選壓力下，僅通過一輪篩選，DN5/pB富集超過16倍，證明了該系統(tǒng)可以用于菌株進(jìn)化。本論文嘗試在質(zhì)粒pB的基礎(chǔ)上通過優(yōu)化NeuAc合成途徑中四個基因的表達(dá)來提高NeuAc生產(chǎn)。本論文設(shè)計(jì)了兩種RBS文庫，分別包含497，664和65，536種突變體，經(jīng)過初步表征，來自文庫一的菌株積累NeuAc能力更強(qiáng)，所以在接下來的實(shí)驗(yàn)中采用了文庫一。
　　將文庫在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到指數(shù)后期時，將培養(yǎng)物

12、按1％轉(zhuǎn)接到新鮮的篩選培養(yǎng)基中。在三次連續(xù)傳代（稱為一個富集循環(huán)）后，提取質(zhì)粒并重新轉(zhuǎn)化新鮮親本菌株以防止細(xì)胞產(chǎn)生對鎳離子的適應(yīng)性突變。通過3輪篩選進(jìn)化，富集到3個高產(chǎn)質(zhì)粒p1e、p2、p3e，富集率超過40％。富集質(zhì)粒中，neuB、slr1975、GNA1三個基因的表達(dá)強(qiáng)度較pB高（除了p2e-GNA1），但glmS強(qiáng)度較低。其中產(chǎn)量最高的DN5/p2e較原始菌株NeuAc產(chǎn)量提高了34％，達(dá)到2.12g/L。在此基礎(chǔ)上本論文對Neu

13、Ac合酶NeuB進(jìn)行了隨機(jī)突變，經(jīng)過4輪篩選進(jìn)化，富集了B1、B3兩個突變體，富集率分別為56.5％和45％。DN5/pB1產(chǎn)量為2.24g/L，DN5/pB3產(chǎn)量為2.61g/L（相比DN5/p2e提高了23％）。本論文將NeuB突變體進(jìn)行了蛋白表達(dá)純化并對其酶活進(jìn)行了測定，B3較野生型提高了27％，B1較野生型提高了9.4％。
　　為探究單個氨基酸突變及組合的氨基酸突變對酶活及NeuAc生產(chǎn)的影響，本論文構(gòu)建了C1，C2和C3

14、突變體。但遺憾的是，未能進(jìn)一步提高NeuAc產(chǎn)量。為衡量DN5/pB3生產(chǎn)NeuAc的能力，本論文采用無機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行了雙階段發(fā)酵。在該策略中，要求產(chǎn)物生產(chǎn)與細(xì)胞生長不存在偶聯(lián)。第一階段是生物量積累階段，第二階段是將積累的細(xì)胞重懸到適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行產(chǎn)物生產(chǎn)。經(jīng)44h發(fā)酵，菌株積累8.31g/L NeuAc。副產(chǎn)物方面，丙酮酸和GlcNAc積累量較多，其余如ManNAc、甲酸、乙酸、乙醇較少。通過對發(fā)酵初始生物量的優(yōu)化，NeuAc產(chǎn)量進(jìn)

15、一步提高到12.52g/L。
　　本論文采用不可逆的NeuAc合酶進(jìn)行葡萄糖起始的NeuAc發(fā)酵生產(chǎn)，并對宿主菌進(jìn)行了相應(yīng)的積累PEP的改造，一定程度上提高了NeuAc的產(chǎn)量和產(chǎn)率。通過偶聯(lián)細(xì)胞生長的NeuAc高產(chǎn)菌株高通量篩選系統(tǒng)的建立，本論文利用隨機(jī)突變對NeuAc生產(chǎn)途徑進(jìn)行了表達(dá)強(qiáng)度優(yōu)化并對關(guān)鍵酶NeuAc合酶進(jìn)行了突變篩選，進(jìn)一步提高了菌株的生產(chǎn)能力。該篩選系統(tǒng)還可以應(yīng)用于NeuAc途徑其它酶的篩選，同時也為其它RNA傳