白地霉PP1315產(chǎn)脂肪酶的純化及固定化催化性能研究.pdf

1、脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)是一類重要的甘油酯鍵水解酶,可以在油水界面上催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油,以及中間產(chǎn)物甘油一酯和甘油二酯,利用脂肪酶的催化特性,將其應(yīng)用于生物柴油工業(yè)有著很好的產(chǎn)業(yè)化前景。生物柴油是由動(dòng)、植物油脂與短鏈醇經(jīng)過酯交換反應(yīng)而獲得的脂肪酸甲酯,是一種潔凈的生物燃料,是石化柴油的優(yōu)質(zhì)替代品。傳統(tǒng)的化學(xué)方法制備生物柴油,存在底物條件比較苛刻,反應(yīng)后處理工序復(fù)雜,環(huán)境污染比較大等缺陷。生物酶法制備生物柴

2、油很好的彌補(bǔ)了這一缺陷,目前脂肪酶的生產(chǎn)水平比較低,酶活較低,且其酶活穩(wěn)定性較差,這些限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用,因此開展相關(guān)的研究工作以提高脂肪酶活力及其穩(wěn)定性具有積極的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 本文以實(shí)驗(yàn)室經(jīng)復(fù)合誘變得到的白地霉PP1315為試驗(yàn)菌種,對(duì)其進(jìn)行分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、脂肪酶的分離純化、脂肪酶的固定化及其催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的研究,主要結(jié)果如下:
　　 利用5 L發(fā)酵罐對(duì)白地霉PP1315產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵過程進(jìn)行了放大,在優(yōu)化

3、條件下發(fā)酵液脂肪酶活力可達(dá)到240.15 U/mL；同時(shí)以該菌株在5 L發(fā)酵罐中分批發(fā)酵的數(shù)據(jù)為依據(jù),建立了分批發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的菌體生長、脂肪酶合成以及基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型,分別如下:
　　 (1)菌體生長動(dòng)力學(xué)模型
　　 X=0.211e0.21083t/23.578+0.00896e0.21083t
　　 (2)脂肪酶合成動(dòng)力學(xué)模型
　　 P=0.917e0.21083t/23.578+0.00896e

4、0.21083t+11.671×ln(0.9996+0.00038e0.21083t)
　　 (3)基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型
　　 S=19.584-0.1401e0.21083t/23.578+0.00869e0.21083t-0.0604×ln(0.9996+0.00038e0.21083t)
　　 所建模型能夠較好描述白地霉PP1315分批發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的動(dòng)態(tài)過程,可以為以后的進(jìn)一步放大試驗(yàn)提供參考。
　　

5、 對(duì)脂肪酶的分離純化工藝進(jìn)行了研究,依次采用超濾、硫酸銨鹽析和Sephadex G-75凝膠過濾層析操作對(duì)脂肪酶進(jìn)行逐級(jí)純化,通過SDS-PAGE電泳對(duì)各步驟的純化結(jié)果進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果顯示純化后的脂肪酶比活力達(dá)到1448.7U/mg,純化倍數(shù)為9.61倍,活力回收率為35.2％。純化后的脂肪酶經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳鑒定顯示一條清晰的條帶,說明該酶為一個(gè)亞基構(gòu)成,其分子量約為35 kDa。
　　 采用國產(chǎn)LX-1000HA樹

6、脂對(duì)脂肪酶進(jìn)行固定化研究。運(yùn)用單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合對(duì)影響LX-1000HA樹脂固定化脂肪酶的主要因素進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示最佳固定化條件為:酶液pH7.486、固定化溫度為26.295℃、載體投放量為2.469 g、固定化時(shí)間為24 h,此時(shí)固定化脂肪酶酶活達(dá)到415.151 U/g,酶活回收率提高至47.79％,蛋白固定率為90.43％,說明將LX-1000HA樹脂用于脂肪酶的固定化是可行的。
　　 以正