光滑球擬酵母內(nèi)乙酰CoA水平調(diào)控對(duì)其碳代謝流的影響.pdf

1、本文以一株能在胞外大量積累丙酮酸和α-酮戊二酸(α-KG)的光滑球擬酵母(Torulopsisglabrata)四重維生素的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株WSH-IP303為研究菌株，采用外源添加維生素和乙酸、過(guò)量表達(dá)acetyl-CoA合成酶和過(guò)量表達(dá)丙酮酸脫羧酶等三種策略，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Acetyl-CoA/CoA比率，使碳代謝流從過(guò)量積累丙酮酸轉(zhuǎn)向過(guò)量積累α-酮戊二酸。主要研究結(jié)果如下： 1.隨著培養(yǎng)基中唯一碳源乙酸鈉濃度的升高，菌體濃度不斷

2、升高。當(dāng)培養(yǎng)基中乙酸鈉濃度為6g/L時(shí)，細(xì)胞濃度和α-KG濃度(13.5mmol/L)均達(dá)到最大值。此時(shí)，胞內(nèi)acetyl-CoA的濃度為36.63±2.08nmol/gDCW，Acetyl-CoA/CoA的比率為0.13；繼續(xù)添加乙酸鈉(≥6g/L)并不能有效提高細(xì)胞濃度、acetyl-CoA含量和α-KG的產(chǎn)量；在葡萄糖乙酸混合發(fā)酵培養(yǎng)基中添加乙酸鈉濃度為6g/L時(shí)，α-KG的產(chǎn)量達(dá)到最高值13.35g/L，胞內(nèi)Acetyl-CoA

3、為6.09±0.61μmol/gDCW，Acetyl-CoA/CoA比值達(dá)到0.47，此時(shí)Cα-KG/CPYR為0.46；通過(guò)外源增加VB1和乙酸鈉濃度均可以加強(qiáng)acetyl-CoA的合成，胞acetyl-CoA水平隨著培養(yǎng)基中VB1和乙酸鈉濃度的增加而增加，同時(shí)促進(jìn)了α-KG的合成。當(dāng)VB1的濃度為0.015mg/L時(shí)，α-KG的產(chǎn)量最高達(dá)13.02g/L，胞內(nèi)Acetyl-CoA為6.42μmol/gDCW，Acetyl-CoA/C

4、oAL比值達(dá)到0.92，CμKG/CPYR的值為0.50。 2.為了研究acetyl-CoA及其衍生物在細(xì)胞內(nèi)的形式和含量對(duì)代謝途徑及代謝流量的影響。將來(lái)源于釀酒酵母中編碼acetyl-CoA合成酶ACS2基因過(guò)量表達(dá)于發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸的工業(yè)菌株Torulopsisglabrata中，獲得了一株acetyl-CoA合成酶活性提高了9.2倍(1.20U/mgprotein)的重組菌T.glabrataACS2-1。與出發(fā)菌株WSH

5、-IP303相比，重組菌T.glabrataACS2-1:(1)能以乙酸為唯一碳源在胞內(nèi)積累0.94μmol/gDCW的acetyl-CoA；(2)以葡萄糖為唯一碳源時(shí)胞acetyl-CoA濃度、α-KG產(chǎn)量和Cα-KG/Cpyr是出發(fā)菌株WSH-IP303的3.22、2.05和2.52倍；(3)在葡萄糖培養(yǎng)基中添加4g/L乙酸，導(dǎo)致acetyl-CoA濃度、α-KG產(chǎn)量和Cα-KG/Cpyr是出發(fā)菌株WSH-IP303的4.55、2.

6、47和3.75倍，α-KG濃度達(dá)到17.8g/L。 3.將來(lái)源于釀酒酵母中編碼丙酮酸脫羧酶PDC1基因過(guò)量表達(dá)于發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸的工業(yè)菌株Torulopsglabrata中，獲得了一株丙酮酸脫羧酶活性提高了14.2倍(7.22±0.09U/mgprotein-1)的重組菌T.glabrataPDC1-1。在葡萄糖培養(yǎng)基中添加30g/L丙酮酸時(shí)，重組菌TglabrataPDC1-1與對(duì)照菌株T.glabrata：：pYES2相比：

7、(1)丙酮酸脫羧酶活性提高了14.16倍(7.22±0.09U·mgofprotein-1)；(2)重組菌株T.glabrataPDC1-1α-KG產(chǎn)量和Cα-KG/Cpyr分別為：38.8g/L和1.39，分別是對(duì)照菌的182％和284％；(3)重組菌T.glabrataPDC1-1胞內(nèi)acetyl-CoA節(jié)點(diǎn)代謝通量和acetyl-CoA/CoA比對(duì)照菌分別提高了2.38倍和3.76倍，達(dá)到17.55μmol/gDCW和2.37，而