光滑球擬酵母中ATP的生理功能與作用機(jī)制.pdf

1、本文以一株能在胞外大量積累丙酮酸的光滑球擬酵母的(Torulopsis glabrata)四重維生素(硫氨酸、生物素、吡哆醇和煙酸)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株CCTCC M202019為研究對(duì)象，以闡明能量代謝對(duì)酵母生理過(guò)程的影響為目標(biāo)，在初步了解T.gtabrata中能量代謝途徑的基礎(chǔ)上，運(yùn)用代謝工程和微生物生理學(xué)的理論和方法，就ATP代謝途徑如何調(diào)控酵母胞內(nèi)微環(huán)境，并影響細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物積累的機(jī)制展開(kāi)研究。主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)

2、有機(jī)整合融合PCR、酵母高效電轉(zhuǎn)化、制霉菌素富集和限制性培養(yǎng)基篩選等技術(shù)手段，建立了一種針對(duì)酵母的無(wú)抗性標(biāo)記并可重復(fù)使用的大片段缺失營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株構(gòu)建方法，并成功構(gòu)建了尿嘧啶缺陷型(△ura3)、精氨酸缺陷型(△arg8)和尿嘧啶精氨酸雙缺陷型(△ura3△arg8)等三株T.glabrata營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。在此基礎(chǔ)上，驗(yàn)證了含有2μm片段的酵母載體在T.glabrata中的穩(wěn)定性，并實(shí)現(xiàn)了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的可誘導(dǎo)表達(dá)；
　　

3、 (2)ATP8、ATP6和ATP9基因分別編碼F0Fl-ATP合成酶的三個(gè)重要亞基，均位于線粒體基因組上(mtDNA)。以一個(gè)線粒體重新編碼的ARG8m基因作為篩選標(biāo)記，利用同源重組策略敲除ATP8、ATP6和ATP9基因。在這一過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，野生型和轉(zhuǎn)化的mtDNA能同時(shí)存在于轉(zhuǎn)化子中，且隨著培養(yǎng)條件的改變，兩種mtDNA所占的比例會(huì)發(fā)生規(guī)律性變化。作者將這一現(xiàn)象命名為單細(xì)胞線粒體基因組多態(tài)性(Single cellmitochond

4、rial genome polymorphism，SCMGP)。研究表明，mtDNA不穩(wěn)定性、線粒體融合/分裂過(guò)程和mtDNA的選擇性丟失是形成SCMGP現(xiàn)象的主要因素。在理解SCMGP現(xiàn)象形成機(jī)制的基礎(chǔ)上，建立了利用厭氧培養(yǎng)消除SCMGP現(xiàn)象的策略，獲得了三株僅含有目標(biāo)mtDNA的同質(zhì)體ATP8、ATP6和ATP9缺失菌株，并分別命名為ATP8、ATP6和ATP9；
　　 (3)ATP6缺失可以導(dǎo)致T.glabrata在基本培

5、養(yǎng)基和精氨酸補(bǔ)充培養(yǎng)基中培養(yǎng)24代后的mtDNA丟失率分別達(dá)到42%和63%。胞內(nèi)ATP水平、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)濃度、線粒體膜間腔(Mitochondrial intermembrane space，MIMS)中的pH值、跨膜電勢(shì)(△ψm)及烏頭酸酶的表達(dá)水平與酶活性均表明，MIMS中H+的過(guò)量積累是導(dǎo)致ATP6缺失突變株mtDNA不穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。當(dāng)細(xì)胞缺失ATP6基因后，發(fā)揮離子通道作用

6、的α亞基丟失，導(dǎo)致MIMS中積累的H+無(wú)法通過(guò)F0F1-ATP合成酶得到釋放，導(dǎo)致ROS水平升高，干擾線粒體基質(zhì)蛋白的定位，系統(tǒng)性的影響mtDNA的穩(wěn)定性。為了提高ATP6敲除突變菌株mtDNA在不同培養(yǎng)條件下的穩(wěn)定性，將來(lái)源于莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)的交替氧化酶基因AOX1和來(lái)源于乳酸乳球菌(Lactobacillus lactis)的NADH氧化酶基因noxE表達(dá)于ATP6缺失突變株中，顯著提高

7、了mtDNA穩(wěn)定性，兩株菌分別命名為AOX和NOX；
　　 (4)以前面得到的一系列ATP合成酶缺失突變株為對(duì)象，研究了胞內(nèi)ATP水平變化對(duì)細(xì)胞生理過(guò)程的影響。ATP8、ATP6和ATP9三個(gè)基因的敲除顯著降低了ATP水平，強(qiáng)烈的抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)，48 h時(shí)的菌體干重分別降低了46.9%、44.2%和59.8%。在發(fā)酵初期，由于F0F1-ATP合成酶活性缺失導(dǎo)致的胞內(nèi)ATP水平下降，ATP8、ATP6、ATP9和NOX的胞內(nèi)AT

8、P水平分別為出發(fā)菌株的65.5%、62.0%、48.4%和73.0%。ATP水平的降低顯著解除了ATP對(duì)糖酵解途徑關(guān)鍵酶活性的抑制，加速了糖酵解速率。但隨著發(fā)酵繼續(xù)進(jìn)行至28 h后，ATP合成酶缺失菌株的糖酵解速率顯著下降。研究表明，ATP合成酶缺失菌株中ATP水平的顯著下降和ROS水平的顯著提高，導(dǎo)致細(xì)胞抵御酸脅迫和滲透壓脅迫的能力顯著下降。在胞質(zhì)中表達(dá)NADH氧化酶基因noxE可以促進(jìn)NADH代謝，降低胞內(nèi)ROS水平，改善胞內(nèi)微環(huán)境

9、，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和丙酮酸的積累。代謝網(wǎng)絡(luò)通量、中心代謝途徑關(guān)鍵酶表達(dá)水平和酶活性分析表明，F(xiàn)0F1-ATP合成酶缺失對(duì)胞質(zhì)中的糖酵解途徑具有顯著影響，而對(duì)位于線粒體基質(zhì)中的三羧酸循環(huán)影響較小，表明線粒體的亞細(xì)胞區(qū)隔可以有效保護(hù)其中進(jìn)行的物質(zhì)合成和產(chǎn)能代謝途徑；
　　 (5)真核微生物細(xì)胞依靠一系列ATP酶，利用水解ATP產(chǎn)生的能量，進(jìn)行H+和其它離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，以維持各亞細(xì)胞區(qū)隔間的pH梯度。當(dāng)胞外pH較低時(shí)，細(xì)胞需要消耗更多的A

10、TP維持更高的pH梯度。為了研究胞內(nèi)ATP水平在細(xì)胞應(yīng)對(duì)脅迫過(guò)程中的作用，通過(guò)在培養(yǎng)基中添加檸檬酸鹽促進(jìn)ATP供給，研究低pH條件下T.glabrata的細(xì)胞生長(zhǎng)和丙酮酸生產(chǎn)。結(jié)果表明，ATP供給的增強(qiáng)顯著促進(jìn)了依賴于ATP的胞內(nèi)pH平衡過(guò)程，使培養(yǎng)基、胞質(zhì)和液泡之間的pH梯度得到顯著提高。pH梯度與胞內(nèi)ATP濃度之間的量化關(guān)系表明胞內(nèi)ATP濃度的上升可以顯著的促進(jìn)相關(guān)的pH平衡過(guò)程。此外，T.glabrata CCTCC M20201