CD2AP在足細胞中的生理功能研究.pdf

1、第一部分、CD2AP在腎臟細胞中的分布及其在足細胞中的作用初探。 目的：觀察CD2相關(guān)蛋白（CD2AP）在腎臟不同細胞系中的表達分布，及其與足細胞裂孔隔膜分子nephrin和細胞骨架蛋白F-actin之間的聯(lián)系。 方法：以DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人系膜細胞（HMC）和人腎小管上皮細胞系（HK-2），RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)條件永生化小鼠足細胞系。以RT-PCR及Western blot方法檢測足細胞內(nèi)CD2AP和nephr

2、in的表達。間接免疫熒光結(jié)合激光共聚焦方法觀察CD2AP在HMC、HK-2、未分化及已分化足細胞中的表達情況，及CD2AP與nephrin在足細胞中的共存。直接免疫熒光結(jié)合激光共聚焦方法觀察F-actin在足細胞的表達及其與CD2AP的共存。 結(jié)果：CD2AP均勻分布于HK-2及未分化足細胞的核周及胞漿，而不表達于HMC細胞。在足細胞分化過程中，CD2AP的分布發(fā)生了變化，出現(xiàn)向周邊聚集的現(xiàn)象。CD2AP與足細胞裂孔隔膜分子ne

3、phrin及細胞骨架蛋白F-actin在足細胞中存在共定位關(guān)系。 結(jié)論：CD2AP表達于上皮來源的腎臟固有細胞。CD2AP在足細胞中的分布特點，提示CD2AP可能參與足細胞的分化過程，并與裂孔隔膜分子功能及細胞骨架調(diào)節(jié)有關(guān)。 第二部分、CD2AP在足細胞中的生理功能研究。 論文1：CD2AP在足細胞分化中的作用。 目的：本文旨在研究未分化和分化足細胞生物學(xué)性狀及CD2相關(guān)蛋白（CD2AP）在足細胞分化過程

4、中的作用。 方法：體外33 ℃許可條件下培養(yǎng)由H-2Kb-tsA58轉(zhuǎn)基因小鼠所建立的未分化足細胞系，并在37 ℃非許可條件下誘導(dǎo)其分化。觀察足細胞分化后形態(tài)學(xué)改變；MTT法測定細胞的生長曲線；紅色熒光染料PKH-26標記足細胞，追蹤其在子代細胞中的分布，檢測細胞增殖能力；流式細胞儀檢測細胞周期的改變；Western印跡檢測足細胞相關(guān)蛋白CD2AP、α-actinin和足細胞分化相關(guān)蛋白nephrin的表達；免疫熒光結(jié)合激光共聚

5、焦方法檢測CD2AP、nephrin、α-actinin、F-肌動蛋白和微管蛋白的表達變化。用CD2AP siRNA轉(zhuǎn)染未分化足細胞后置于37℃非許可條件下培養(yǎng)，并設(shè)非許可條件下未轉(zhuǎn)染組為對照組。檢測足細胞的生長速度的變化以及足細胞分化標志物synaptopodin的表達。 結(jié)果：與未分化足細胞相比，分化足細胞形態(tài)發(fā)生改變，生長速度減慢，增殖能力下降（P<0.05）；細胞周期表現(xiàn)為G0/G1期細胞比例的增多和S期及G2/M期的細

6、胞比例下降（P<0.05）；CD2AP、nephrin和α-actinin的表達明顯增高（P<0.05）；CD2AP、nephrin、α-actinin、F-肌動蛋白和微管蛋白在表達分布上均發(fā)生明顯的改變。Synaptopodin僅表達于已分化足細胞，在未分化足細胞無表達。轉(zhuǎn)染特異性siRNA下調(diào)CD2AP表達后，細胞生長速度明顯減慢，synaptopodin mRNA表達下調(diào)（P<0.05），細胞分化遲滯。 結(jié)論：足細胞分化過

7、程中伴隨細胞骨架的重新分布和細胞形態(tài)的改變；CD2AP可能作為足細胞裂孔隔膜分子與細胞骨架的連接蛋白，在足細胞分化過程中發(fā)揮重要作用。 論文2：CD2AP在足細胞增殖和分裂中的作用。 目的：觀察敲低足細胞CD2相關(guān)蛋白（CD2AP）表達對細胞增殖和分裂的影響，探討CD2AP在足細胞損傷和蛋白尿發(fā)病機理中的作用。 方法：采用RPMI 1640培養(yǎng)基，在33℃許可條件下培養(yǎng)永生化小鼠足細胞系。以PKH-26紅色熒光染

8、料標記足細胞后，用Metafectene轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染針對CD2AP的小分子干擾RNA（siRNA）。轉(zhuǎn)染24h后流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率；48h 后RT-PCR和Western印跡檢測轉(zhuǎn)染后CD2AP mRNA和蛋白表達；72h后以流式細胞儀檢測足細胞增殖指數(shù)及細胞周期；用Oregon Green? 488標記的Paclitaxel直接標記足細胞內(nèi)的微管蛋白，激光共聚焦顯微鏡下檢測雙核及多核足細胞的比例。 結(jié)果：流式細胞儀結(jié)果顯示

9、，CD2AP特異性siRNA轉(zhuǎn)染效率為66.27％。轉(zhuǎn)染siRNA 48h后，CD2AP mRNA和蛋白表達分別下降57％和39％。轉(zhuǎn)染72h后，足細胞增殖指數(shù)明顯下降（p<0.05），G2/M期的細胞數(shù)量明顯增多（p<0.05）。共聚焦顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染CD2AP siRNA后，部分細胞有絲分裂后不能分離，雙核及多核足細胞的比例明顯增加（p<0.05）。 結(jié)論：CD2AP表達降低可能通過阻礙足細胞增殖和有絲分裂，導(dǎo)致足細胞損傷。

10、 論文3：CD2AP在足細胞黏附和胞質(zhì)伸展中的作用。 目的：觀察抑制足細胞CD2相關(guān)蛋白（CD2AP）表達對細胞黏附和胞質(zhì)伸展功能的影響，并初步探討其機制。 方法：用RPMI 1640培養(yǎng)基33℃下培養(yǎng)小鼠未分化足細胞系，轉(zhuǎn)染針對CD2AP的小分子干擾RNA（siRNA），設(shè)無特異靶位點的Scrambing序列即Control siRNA轉(zhuǎn)染組作對照。48h后將轉(zhuǎn)染的足細胞制備成單細胞懸液，接種于預(yù)鋪有Ⅳ型膠原蛋

11、白的96孔板內(nèi)，33℃下培養(yǎng)90min后檢測足細胞的貼壁率和細胞的伸展面積，流式細胞儀檢測抑制CD2AP后足細胞的凋亡率以及在不同PAN刺激下足細胞的凋亡率。激光共聚焦顯微鏡下檢測微絲蛋白的分布變化。Western印跡和免疫共沉淀檢測nephrin蛋白的表達及其磷酸化水平。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染CD2AP siRNA足細胞的黏附率和細胞伸展的面積明顯低于對照組（P<0.05）；轉(zhuǎn)染CD2AP siRNA后48h足細胞的凋亡率高于對照組，有

12、統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。100μg/ml的PAN能明顯誘導(dǎo)足細胞的凋亡，減少足細胞的黏附率（P<0.05）。敲低CD2AP的表達后足細胞微絲蛋白的分布發(fā)生明顯的變化，nephrin蛋白表達和磷酸化水平下降（P<0.05）。 結(jié)論：敲低CD2AP的表達使足細胞易于凋亡，影響細胞的黏附功能；足細胞骨架蛋白的紊亂和nephrin信號通路的抑制可能是足細胞黏附和伸展功能下降的機制。 第三部分、CD2AP在白蛋白內(nèi)吞中的作用機

13、制初探。 目的：觀察足細胞對白蛋白的吞噬作用以及白蛋白過負荷對足細胞的損傷，并探討CD2AP在其中的作用。 方法：本研究采用化學(xué)方法制備FITC標記的白蛋白，在33℃許可條件下培養(yǎng)由H-2Kb-tsA58轉(zhuǎn)基因小鼠所建立的未分化足細胞系，并模擬體內(nèi)足細胞在腎小球鮑曼氏囊內(nèi)所處的蛋白尿環(huán)境，免疫熒光結(jié)合激光共聚焦方法研究足細胞對白蛋白的吞噬功能以及 CD2AP與FITC-BSA在足細胞中的共定位，Western印跡檢測CD

14、2AP的表達，流式細胞儀檢測足細胞的凋亡，透射電鏡檢測細胞的超微結(jié)果變化。 結(jié)果：在生理范圍尿白蛋白濃度下（0.05mg/ml），即可發(fā)現(xiàn)足細胞對白蛋白具有吞噬功能。在大劑量白蛋白濃度下（1mg/ml），足細胞吞噬白蛋白存在時間效應(yīng)，呈S型曲線，在2h后達到平衡狀態(tài)。激光共聚焦顯微鏡證實在CD2AP與FITC-BSA在足細胞內(nèi)存在共聚關(guān)系。BSA刺激12h后CD2AP的表達明顯上調(diào)，凋亡的足細胞增多，細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。