MFG-E8在小膠質(zhì)細(xì)胞生理功能中的作用研究.pdf

1、小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)常駐的免疫細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫防御病原體感染過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的作用。當(dāng)接觸到內(nèi)源性信號(hào)(如神經(jīng)元功能紊亂/死亡、異常蛋白的聚集或免疫細(xì)胞的相互作用)或是外源性刺激信號(hào)(如感染)時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞可迅速由靜息狀態(tài)激活，從而發(fā)揮組織修復(fù)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)支持、引發(fā)炎癥或激活淋巴細(xì)胞等作用。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放一些抗炎成分(如IL-10、TGF-β)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，NGF)來(lái)保護(hù)和維持受損神經(jīng)元，同時(shí)也釋放促炎癥

2、因子(如前列腺素、TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子)、分泌蛋白酶以及生成活性氧(reactive oxygen species，ROS)。炎癥反應(yīng)有利于機(jī)體清除入侵的病原微生物，清除損傷壞死的細(xì)胞及異常聚集沉積的蛋白質(zhì)，促進(jìn)損傷組織的修復(fù)。但是過(guò)度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)毒性作用，過(guò)強(qiáng)的炎癥反應(yīng)會(huì)進(jìn)一步加重組織損傷，長(zhǎng)期的炎癥刺激則可發(fā)展成慢性炎癥性疾病。有研究指出，以小膠質(zhì)細(xì)胞活化為特征的炎癥是許多神經(jīng)變性疾病發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵

3、環(huán)節(jié)。故在治療和減緩神經(jīng)系統(tǒng)疾病過(guò)程中，應(yīng)避免小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷。同時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，也是抗炎藥物重要的靶點(diǎn)。
　　 小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞識(shí)別、吞噬凋亡細(xì)胞主要由復(fù)雜的蛋白受體介導(dǎo)，其分子機(jī)制是目前神經(jīng)免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，乳脂小球表皮生長(zhǎng)因子Ⅷ(Milk Fat GlobuleEpidermal Growth Factor8，MFG-E8)是介導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞的關(guān)鍵因

4、子。巨噬細(xì)胞分泌蛋白MFG-E8連接到凋亡細(xì)胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)，然后錨定到巨噬細(xì)胞表面的整合素αvβ5，啟動(dòng)巨噬細(xì)胞內(nèi)CrkⅡ-DOCK180-Rac1信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白骨架重排，進(jìn)而發(fā)揮吞噬作用。而外源性加入MFG-E8的同分異構(gòu)體D89E蛋白，可以有效封閉該通路，抑制細(xì)胞的吞噬活性，加重炎癥反應(yīng)。2004年，Hanayama等在基因敲除MFG-E8的老鼠模型中發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞雖

5、然可以通過(guò)其他途徑結(jié)合凋亡細(xì)胞，但不能吞噬凋亡細(xì)胞而導(dǎo)致大量凋亡細(xì)胞的沉積，最終引起脾臟腫大和嚴(yán)重的自身免疫性疾病。該研究肯定了MFG-E8-αvβ5-Rac1信號(hào)通路的獨(dú)特性和重要性。在小膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，外源性添加MFG-E8能夠促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬。而加入MFG-E8的同分異構(gòu)體D89E抑制小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬。在此基礎(chǔ)上，我們推測(cè)MFG-E8在調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬行為中發(fā)揮重要作用。然而，其調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)

6、胞的吞噬是否通過(guò)PS-MFG-E8-αvβ5-Rac1信號(hào)通路來(lái)完成，以及小膠質(zhì)細(xì)胞活化后吞噬功能與炎癥反應(yīng)之間是何種關(guān)系，目前尚無(wú)研究。
　　 本研究通過(guò)分別阻斷與過(guò)表達(dá)MFG-E8在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，從小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬過(guò)程入手，制備紅細(xì)胞PS外翻凋亡模型，觀察小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)PS外翻凋亡紅細(xì)胞的吞噬作用。分析內(nèi)源性MFG-E8的改變對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬能力的影響。在此基礎(chǔ)上，分析小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能與炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系。研究分為三部

7、分：
　　 一，將磷脂酰絲氨酸以脂質(zhì)體的形式整合到正常紅細(xì)胞表面，構(gòu)建PS外翻的紅細(xì)胞凋亡模型。利用共培養(yǎng)技術(shù)，檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)凋亡紅細(xì)胞的吞噬情況，同時(shí)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用時(shí)炎癥因子表達(dá)量的變化。
　　 通過(guò)脂質(zhì)體整合，得到紅細(xì)胞PS外翻率為7.4％～47.5％。其中，經(jīng)NEM(20μM，10min)處理后，再與PSox脂質(zhì)體整合的紅細(xì)胞PS外翻率為35.7％，相對(duì)于經(jīng)NEM(30μM，30min)處理后再整合P

8、Sox的紅細(xì)胞PS外翻率47.5％更為穩(wěn)定。故我們采用PS外翻率為35.7％的紅細(xì)胞進(jìn)行下一步的吞噬實(shí)驗(yàn)。在吞噬檢測(cè)中，相對(duì)于正常對(duì)照組，小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)凋亡紅細(xì)胞的吞噬率具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(27.5％±5.4％vs3.8％±1.0％，p<0.01)。同時(shí)，Real-time PCR檢測(cè)吞噬紅細(xì)胞后小膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥因子IL-1β和TNF-α發(fā)現(xiàn)。相對(duì)于正常組，實(shí)驗(yàn)組小膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)隨著其吞噬功能的增加而下降。
　　 二，分

9、別構(gòu)建MFG-E8過(guò)表達(dá)載體和RNA干擾慢病毒表達(dá)載體，檢測(cè)其過(guò)表達(dá)和阻斷MFG-E8表達(dá)的效率。MFG-E8過(guò)表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細(xì)胞后，通過(guò)檢測(cè)GFP融合蛋白判斷小膠質(zhì)細(xì)胞中MFG-E8表達(dá)增加。同時(shí)，用RNA干擾載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，Real-time PCR和Western Blotting檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞中MFG-E8的表達(dá)，結(jié)果顯示可有效阻斷MFG-E8的表達(dá)。
　　 三，用過(guò)表達(dá)載體和RNA干擾載體轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細(xì)胞，檢測(cè)小

10、膠質(zhì)細(xì)胞中MFG-E8的表達(dá)變化。內(nèi)源性調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞中MFG-E8的表達(dá)后，檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)凋亡紅細(xì)胞的吞噬率，同時(shí)檢測(cè)吞噬后小膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)。
　　 MFG-E8過(guò)表達(dá)和RNA干擾轉(zhuǎn)染后，相對(duì)于對(duì)照組，過(guò)表達(dá)MFG-E8的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)凋亡紅細(xì)胞的吞噬率有明顯提高(32.9％土9.6％vs21.5％±6.28％，p<0.01)；而相對(duì)于對(duì)照組，阻斷MFG-E8的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)凋亡紅細(xì)胞的吞噬受到明顯抑制(17.5％±4

11、.1％vs22.2％±7.8％，p<0.01)。同時(shí)，MFG-E8表達(dá)上升引起小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬能力增加的同時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的炎癥因子也明顯增加；相反，阻斷MFG-E8的表達(dá)引起小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬能力下降的同時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的炎癥因子也減少。
　　 研究表明，內(nèi)源性改變小膠質(zhì)細(xì)胞中MFG-E8的表達(dá)變化，能夠影響其吞噬功能。促進(jìn)MFG-E8的表達(dá)可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)PS外翻的凋亡紅細(xì)胞的吞噬能力。同時(shí)炎癥因子表達(dá)上升；相反，阻斷MF