從桃紅芪術(shù)軟肝煎抗肝纖維化探討孫桂芝教授防治肝癌經(jīng)驗內(nèi)涵.pdf

1、孫桂芝教授是著名的中西醫(yī)結(jié)合腫瘤專家，從事臨床腫瘤防治工作近60年，診治中晚期腫瘤患者幾十萬人，尤以治療消化道腫瘤而著稱，運用“治未病”思想治療肝纖維化/肝硬化、防治肝癌積累了豐富的臨床經(jīng)驗。肝癌死亡率位居我國腫瘤死亡率第3位，并且肝癌發(fā)展迅速，患者生存期較短。我國是乙肝大國，“肝炎-肝纖維化/肝硬化-肝癌”是肝癌發(fā)展的3部曲，研究發(fā)現(xiàn)80％肝癌患者發(fā)病于肝纖維化，結(jié)合祖國醫(yī)學(xué)“治未病”思想，孫桂芝教授認(rèn)為對于肝癌的防治應(yīng)當(dāng)以防為主，防

2、治結(jié)合，具體表現(xiàn)為:“未病先防”即防治肝纖維化/肝硬化;“既病防變”即積極治療肝纖維化/肝硬化，防止向肝癌進展;“治病于初”，即積極治療肝纖維化/早期肝硬化。
　　本課題通過總結(jié)孫桂芝教授臨床治療肝纖維化/肝硬化經(jīng)驗，選取具有肝纖維化/肝硬化病史的原發(fā)性肝癌35例進行前瞻性臨床研究，采用“無尺度網(wǎng)絡(luò)”和主題模型技術(shù)進行挖掘分析，對孫桂芝老師治療肝纖維化防治肝癌臨床辨證施治特點及遣方用藥規(guī)律進行深度解析，在此基礎(chǔ)上，采用體內(nèi)、外實驗

3、相結(jié)合方法，對孫桂芝治療肝纖維化防治肝癌經(jīng)驗方“桃紅芪術(shù)軟肝煎”從阻斷肝纖維化生成、TGF-β/Smad信號通路調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化實驗研究，從一個側(cè)面闡釋孫桂芝老師學(xué)術(shù)思想的科學(xué)內(nèi)涵。
　　論文主要內(nèi)容分為三部分:
　　第一部分:對孫桂芝教授辨治肝纖維化/肝硬化，防治肝癌的學(xué)術(shù)思想及診療特點進行理論挖掘。
　　從肝纖維化古今文獻挖掘和臨床跟師學(xué)習(xí)，深入領(lǐng)會孫桂芝老師治療肝纖維化/肝硬化，防治肝癌的學(xué)術(shù)思想。
　　1

4、.基于孫桂芝老師的“未病先防”思想從“益氣活血，軟堅散結(jié)”“補益脾胃”治療肝纖維化。
　　2.孫桂芝老師認(rèn)為肝癌的治療應(yīng)當(dāng)以“益氣活血軟堅解毒”為治療大法，常用黃芪建中湯、藤虎湯、活血利水方等治療。
　　第二部分臨床研究:對孫桂芝教授臨床抗肝纖維化防治肝癌診療特點進行數(shù)據(jù)挖掘和療效分析。
　　分析35例既往有肝硬化/肝纖維化病史的原發(fā)性肝癌患者的臨床信息，進行前瞻性分析，采用“無尺度網(wǎng)絡(luò)”和主題模型技術(shù)挖掘，對孫桂芝老

5、師臨床辯治特點、遣方用藥規(guī)律等進行進深入研究。
　　1.臨床療效:患者客觀療效治療后穩(wěn)定率高于治療前;乏力、神疲懶言、皮膚瘙癢、口干口苦、腹脹痛、急躁易怒、太息、脅痛、水腫等癥狀均有好轉(zhuǎn);谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、甲胎蛋白均下降;白蛋白較治療前上升;紅細胞、白細胞、血紅蛋白、血小板均較治療前升高;生命質(zhì)量評分有明顯提高。
　　2.數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果:在孫桂芝師診治的35例肝癌伴肝纖維化/肝硬化的患者中，總結(jié)出位居前4位的證候-“核心

6、證候”，同時，根據(jù)藥物節(jié)點、緊密度及使用頻次，總結(jié)出對應(yīng)4個核心證候的4個“核心方劑”，其中，“氣滯血瘀核心方劑”對應(yīng)藥物為:醋山甲、醋鱉甲、白芍、玫瑰花、綠鄂梅、陳皮、水紅花子、地龍等?！岸拘扒忠u核心方劑”對應(yīng)藥物為:虎杖、藤梨根、白花蛇舌草、重樓、土茯苓?！把龀煞e核心方劑”對應(yīng)藥物為:醋鱉甲、醋山甲、虎杖、水紅花子、地龍、桃仁、雞內(nèi)金、莪術(shù)等?！捌⒛I不足核心方劑”對應(yīng)藥物為:黃芪、白芍、太子參、制何首烏、枸杞子、女貞子等。根據(jù)主題

7、模型的研究，得出證候與中藥對應(yīng)的概率值較高的5組主題，分別是:心脾兩虛證:多用太子參、當(dāng)歸、土茯苓、遠志、麩炒白術(shù)等藥物;毒邪侵襲證:常加用虎杖、重樓、醋龜甲等藥物;氣滯血郁證多用桃仁、地龍、醋鱉甲、蜈蚣等藥物;血瘀成積證多用炮山甲、醋鱉甲等藥物;脾腎不足證多用黃芪、制何首烏、白芍等藥物;脾虛水停證常用生白術(shù)、豬苓、黃芪等藥物。根據(jù)臨床研究及數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，將數(shù)據(jù)結(jié)果與孫桂芝老師通過提交紙質(zhì)文檔、訪談探討、審閱修改等方式，總結(jié)出孫桂芝老師

8、治療肝癌伴肝纖維化/肝硬化的經(jīng)驗方藥，主要藥物包括:生黃芪、炒白術(shù)、太子參、桃仁、莪術(shù)等藥物。全方有健脾益氣、活血化瘀、軟堅消癥之意，體現(xiàn)孫桂芝老師扶正培本、益氣活血、軟堅散結(jié)的臨證診治思路。
　　第三部分體內(nèi)及體外實驗進行驗證:揭示孫桂芝教授辨治肝纖維化臨床療效的分子機制，闡釋孫桂芝經(jīng)驗的科學(xué)內(nèi)涵。
　　體內(nèi)實驗擬采用50％CCL4橄欖油溶液腹腔注射Wistar大鼠制備肝纖維化大鼠模型，制備肝纖維化模型，造模同時使用“桃紅

9、芪術(shù)軟肝煎”低、中、高劑量干預(yù)治療，并與和秋水仙堿、扶正化瘀膠囊進行對照觀察。于造模給藥3、6、9周3個時間點進行阻斷肝纖維化進展的動態(tài)觀察，和與TGF-β/Smad信號通路調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化直接相關(guān)指標(biāo)的免疫組化蛋白表達和mRNA表達。
　　體外實驗選擇Hep-G2作為低分化的肝臟干細胞，體外加入重組TGF-β蛋白干預(yù)，造體外肝纖維化模型，用“桃紅芪術(shù)軟肝煎”含藥血清體外干預(yù)，免疫熒光法和Western Blot方法檢測桃紅芪術(shù)軟

10、肝煎對Hep-G2細胞相關(guān)蛋白表達量的影響。體內(nèi)外實驗相結(jié)合，探討“桃紅芪術(shù)軟肝煎”治療肝纖維化的療效與機制，為闡釋孫桂芝老師臨床經(jīng)驗的科學(xué)內(nèi)涵提供實驗依據(jù)。
　　1.體內(nèi)實驗療效分析:
　　1.1藥物干預(yù)治療后，不同時間節(jié)點大鼠肝纖維化程度比較
　　第3、6、9周的大鼠肝臟HE染色及Masson染色提示:第3周大鼠肝臟組織發(fā)生部分纖維化，桃紅芪術(shù)中劑量組及高劑量組改善最為明顯;第6周模型組大鼠肝臟組織形成假小葉，提示

11、造模成功，桃紅芪術(shù)軟肝煎及扶正化瘀膠囊、秋水仙堿對于大鼠肝纖維化均具有明顯的緩解作用，桃紅芪術(shù)高劑量組改善較其他組顯著;第9周各組大鼠肝臟組織均形成假小葉，桃紅芪術(shù)中劑量組及高劑量組肝組織結(jié)構(gòu)改善最為明顯。
　　實驗結(jié)果表明，隨著造模給藥時間的延長，各給藥組均有阻斷模型大鼠肝組織纖維化進展的功效。與模型對照組比，第9周時桃紅芪術(shù)高劑量組作用最為明顯。
　　1.2不同時間節(jié)點大鼠肝組織免疫組化蛋白表達結(jié)果。
　　第3、6

12、、9周的大鼠肝臟免疫組化染色病理圖片提示:與空白組相比較，模型組E-cadherin較空白組表達減弱，而TGF-β1、Vimentin、Smad2的表達較空白組表達增強，提示大鼠肝臟組織持續(xù)發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，說明大鼠肝臟纖維化可能是通過發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)發(fā)形成的;與模型對照組比，桃紅芪術(shù)軟肝煎可上調(diào)E-cadherin，下調(diào)TGF-β1及Vimentin、Smad2蛋白表達，提示桃紅芪術(shù)軟肝煎可能通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號通路，降低S

13、mad2蛋白表達，從而下調(diào)TGF-β1，上調(diào)E-cadherin，下調(diào)Vimentin表達，發(fā)揮改善上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，治療肝纖維化的作用，其中以桃紅芪術(shù)軟肝煎中劑量組及高劑量組效果最為顯著。
　　1.3熒光定量PCR檢測肝組織E-cadherin、TGF-β1、Vimentin、Smad2 mRNA表達:
　　第3、6、9周大鼠肝臟組織mRNA表達說明:與空白組相比，模型組E-cadherinmRNA表達量下降，TGF-β1mR

14、NA、Smad2 mRNA、Vimentin mRNA表達量上升，提示肝纖維化形成過程中，大鼠肝臟組織持續(xù)發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，可能是通過TGF-β/Smad信號調(diào)節(jié)發(fā)生的;與模型對照組比，桃紅芪術(shù)軟肝煎可上調(diào)E-cadherinmRNA，下調(diào)TGF-β1mRNA及Vimentin mRNA表達、Smad2 mRNA表達，桃紅芪術(shù)軟肝煎各劑量組均有較好的療效提示桃紅芪術(shù)軟肝煎可能通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號通路，影響調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（E

15、pithelial-mesenchymal transition，EMT），發(fā)揮治療肝纖維化作用。
　　2.體外實驗研究
　　體外研究Hep-G2細胞，使用Recombinant Human TGF-β1誘導(dǎo)制作肝纖維化體外模型，從免疫熒光和Western Blot研究探討桃紅芪術(shù)軟肝煎抗肝纖維化的分子機制。
　　2.1免疫熒光結(jié)果顯示:
　　與空白組比較，模型組細胞E-cadherin表達減弱，Smad2、TG

16、F-β R1、Vimentin表達增強;與模型組比，用藥組可以上調(diào)E-cadherin表達，下調(diào)Smad2、TGF-β R1、Vimentin表達，說明桃紅芪術(shù)軟肝煎低劑量組、桃紅芪術(shù)軟肝煎中劑量組、桃紅芪術(shù)高劑量組及扶正化瘀膠囊組、秋水仙堿組均具有較好療效。
　　2.2 Western Blot蛋白定量分析顯示:
　　與空白組比較，模型組E-cadherin表達下降，Vimentin、TGF-β R1表達上升，說明體外肝纖

17、維化細胞模型造模成功，并且Smad2表達增強，促進TGF-β R1表達增強，從而促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;與模型組相比，桃紅芪術(shù)低、中、高劑量組可以上調(diào)E-cadherin表達，下調(diào)Vimentin、TGF-β R1、Smad2表達，其中以桃紅芪術(shù)軟肝煎中劑量和高劑量組療效最好，扶正化瘀膠囊和秋水仙堿也有相似療效。
　　體內(nèi)實驗從阻斷肝纖維化組織病理變化，肝組織免疫組化蛋白表達、mRNA表達，以及體外實驗Hep-G2細胞免疫熒光和West

18、ern Blot研究，均取得了比較一致的結(jié)果:經(jīng)驗方桃紅芪術(shù)軟肝煎抗肝纖維化療效作用明顯、肯定。研究結(jié)果從一個側(cè)面闡釋了孫桂芝老師治療肝纖維化防治肝癌經(jīng)驗的理論內(nèi)涵。
　　本課題特色與創(chuàng)新之處:
　　1.引入現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)，采用“無尺度網(wǎng)絡(luò)”和“主題模型”技術(shù)分析對35例既往有肝纖維化/肝硬化病史的原發(fā)性肝癌，總結(jié)出“核心證候”對應(yīng)的治則治法及“核心方藥”，通過對孫桂芝老師臨床學(xué)習(xí)、提交紙質(zhì)文檔、訪談探討及審閱批改，對孫

19、桂芝老師治療肝纖維化的辨證特點、病因病機、治療策略、遣方用藥特點進行深層次解析，提出了孫桂芝老師治療肝纖維化運用“益氣活血，軟堅散結(jié)”“補益脾胃”辨治原則和核心方藥，為傳承挖掘名老中醫(yī)經(jīng)驗提供新思路。
　　2.本研究采用大鼠肝纖維化模型和人Hep-G2細胞模型，體內(nèi)外實驗相結(jié)合，從肝纖維化病理組織形態(tài)、E-cadherin、Vimentin、Smad2、TGF-β1、TGF-β R1免疫組化蛋白及RT-PCR測定mRNA基因表達、