基因敲減亞鐵鰲合酶聯合小劑量的ALA誘導原卟啉IX積聚診斷早期腫瘤的實驗研究.pdf

1、背景及目的:
　　內窺鏡容易對很多非隆起型癌灶、原位癌、微小腫瘤漏診，因為其外表及顏色往往與正常組織無異，而分子成像技術有助早期診斷彌補這一缺陷，腫瘤分子成像是一種反映腫瘤組織的病理生理及代謝變化的顯像。PpIX介導的腫瘤分子成像技術的關鍵點在于如何特異地增加腫瘤組織中的內源性PpIX，以致癌組織與正常組織在PpIX的含量上產生差異。目前國內外研究組大多通過應用外源性ALA而達到增加腫瘤組織的PpIX的合成量。然而要在內窺鏡下用肉

2、眼直接觀察到腫瘤病灶，必須使用遠超生理量的大劑量ALA，才能產生足夠的PpIX在腫瘤組織積聚。當大劑量的外源性ALA進入體內后，容易產生全身毒副作用。成為ALA-PpIX分子成像技術在臨床上應用的技術難關。腫瘤細胞表面高表達轉鐵蛋白受體，轉鐵蛋白通過和受體特異性結合從而體現出靶點作用，轉鐵蛋白納米載體從中作為一個傳遞載體通過靶向運輸siRNA聯合應用小劑量的ALA達到PpIX在腫瘤積聚，使熒光增強。用siRNA敲減了FECH，阻擋了Pp

3、IX的去路，聯用了小劑量的ALA增加了PpIX的來源，使得大量PpIX在腫瘤組織內積聚，用肉眼即可辨別出腫瘤部位。本實驗通過裸鼠移植瘤為模型，開展活體動物體表腫瘤熒光成像從而達到檢測早期腫瘤的目的。
　　方法:
　　1、篩選TfR高表達細胞株。選取三株婦科腫瘤細胞，用熒光定量PCR和WesternBlot法分別于不同時間點(12h，24，36)，給予不同濃度的Deferoxamine(0.05mM、0.1mM、0.15mM)

4、檢測腫瘤細胞基因水平和蛋白水平TfR的表達情況。
　　2、用TransMessenger kit(Qiagen)轉染高表達TfR細胞株以沉默FECH在細胞內的表達。檢測TfR高表達細胞株內的PpIX熒光。用高表達TfR細胞株進行以下分組實驗:Control組，ALA組(0.025mM、0.05mM、0.1mM)，mix-siRNA-FECH組(0.16uM),mix-siRNA-FECH組(0.16uM)+ALA(0.025mM)

5、組，mix-siRNA-FECH組(0.16uM)+ALA(0.05mM),mix-siRNA-FECH組(0.16uM)+ALA(0.1mM)檢測各組細胞內的PpIX熒光。
　　3、優(yōu)選ALA的最小劑量:接種高表達TfR細胞株，建立裸鼠腹膜移植瘤模型，待成模后，采取裸鼠瘤內注射的方法，給予不同濃度的ALA(1mg/kg，2.5mg/kg，5mg/kg)，小動物活體成像儀檢測裸鼠腫瘤組織內PpIX熒光。
　　4、檢測動物模型

6、腫瘤組織內的PpIX熒光。檢測動物模型腫瘤組織內的PpIX熒光。對成模的裸鼠，分別進行以下分組:Tf-Liposome組，invivofection組，ALA組，si-FECH組，TfR-liposome-ALA+siRNA-FECH組，TfR-liposome-ALA+invivofection-siRNA-FECH組檢測各組動物腫瘤組織內熒光。
　　結果：
　　1、Hela229、mcf-7、skov3三株不同的細胞株，

7、分別于不同時間點(12h、24h、36h)給予不同濃度的DFO，篩選出了一個高表達TFR細胞株:SKOV3。
　　2、檢測TfR高表達細胞株內的PpIX熒光顯示:Control組沒有熒光，ALA組和siRNA-FECH組有微弱的熒光，但熒光強弱沒有太大差異，ALA+siRNA-FECH組熒光最強。
　　3、動物腫瘤模型:局部注射能出現PpIX熒光所用的最小ALA劑量是5mg/kg。
　　4、裸鼠腫瘤模型中檢測PpIX熒

8、光:Tf-Liposome組，invivofection組，ALA組，沒有熒光。si-FECH組，TfR-liposome-ALA+siRNA-FECH組有輕微熒光或者是背景光，TfR-liposome-ALA+invivofection-siRNA-FECH組Tf-Liposome組具有特異性熒光。
　　結論：
　　基于PpIX介導的分子腫瘤成像技術以及應用外源性ALA而達到增加腫瘤組織的PpIX的合成量，我們用siRNA