黏膜型肥大細胞與結腸炎相關結腸癌發(fā)展關系的研究.pdf

1、炎癥是腫瘤的重要組成部分，大約四分之一的腫瘤起源于慢性炎癥[Grivennikov et al.，2010]，例如炎性腸?。冃越Y腸炎和克羅恩病）相關結腸癌[Mantovani et al.，2008]。慢性炎癥微環(huán)境中浸潤的大量炎性細胞在腫瘤惡性轉化過程中起著重要作用，其中包含大量固有免疫細胞，如巨噬細胞、肥大細胞等。參與一線防御反應的肥大細胞的促瘤作用已在人類和小鼠結腸癌中得到證實，然而人和小鼠肥大細胞至少存在兩個亞群，目前的研究

2、主要關注結締組織型肥大細胞(CTMC)，而較少關注黏膜型肥大細胞(MMC)。本研究通過藥物阻斷黏膜型肥大細胞活化，探索黏膜型肥大細胞在結腸炎向結腸癌惡性轉化過程的作用，并探討潛在的機制。
　　本課題使用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉結腸癌模型，留取AD1、AD2、AD3期升、降結腸組織及同齡小鼠全結腸組織。前期mRNA表達的組織芯片分析發(fā)現(xiàn)，結腸炎向結腸癌發(fā)展過程中，肥大細胞相關蛋白酶(MCPs)轉錄豐度逐漸增加，AD3期達最高，其中

3、MMC特異性蛋白酶(mMCP-1，mMCP-2)增加幅度最大;qRT-PCR檢測證實了組織芯片結果;甲苯胺藍染色檢測不同時期肥大細胞的變化，mMCP-1免疫組化染色分析MMC數(shù)目的變化。以上數(shù)據(jù)提示結腸炎向結腸癌發(fā)展過程中，結腸組織MMC數(shù)量逐漸增多。隨后我們使用藥物阻斷肥大細胞，選取主要作用于MMC的色甘酸二鈉(DSCG)及特異性針對CTMC的酮替芬(Ketotifen)，在DSS間歇期灌胃給藥2周，至AD3期，并評估結腸腫瘤發(fā)展情況

4、。炎癥發(fā)生前給予DSCG阻斷肥大細胞活化，在5個不同時間點處置小鼠，收集標本待檢測，并在第14周評估MMC阻斷情況:甲苯胺藍染色檢測結腸組織肥大細胞數(shù)目、免疫組織化學檢測結腸組織MMC數(shù)目、ELISA檢測血清mMCP-1水平、qRT-PCR檢測結腸組織mMCPs轉錄水平;隨后評估結腸腫瘤發(fā)展情況。同時探討了MMC發(fā)揮作用的潛在機制，分析不同時間點血清mMCP-1的水平及結腸上皮內細胞中CD11b+Gr-1+MDSCs數(shù)量的變化。

5、　　結腸上皮不典型增生期是結腸炎向結腸癌惡性轉化的關鍵時期，基于以上研究，我們于不典型增生期阻斷肥大細胞活化進行治療，即在第10周給予AOM/DSS小鼠1周DSCG或3天Doxantrazole（非選擇性肥大細胞膜穩(wěn)定劑），并設置相應溶劑對照組。評估肥大細胞阻斷情況:甲苯氨藍染色檢測肥大細胞數(shù)目，ELISA檢測血清及結腸組織間液mMCP-1水平，隨后評估結腸腫瘤情況。以上實驗結果提示，mMCP-1可能與CD11b+Gr-1+MDSCs的

6、募集有重要關聯(lián)。健康小鼠腹腔注射不同濃度mMCP-1及生理鹽水，24 hr后行腹腔盥洗收獲細胞，流式染色分析CD11b+Gr-1+細胞比例的變化。
　　實驗結果:從AD1到AD3期，結腸組織MMC數(shù)目逐漸增加，AD3期最多。AOM注射兩天之后，損傷結腸組織肥大細胞迅速募集。炎癥發(fā)生前給DSCG可顯著阻斷黏膜型肥大細胞:黏膜型肥大細胞數(shù)目減少;血清mMCP-1水平顯著下降;mMCP-1和mMCP-2轉錄水平顯著下調，而結締組織型肥大

7、細胞相關基因(Cpa3，mMCP-4，mMCP-6)轉錄水平則無顯著差異;同時結腸腫瘤數(shù)目、大小及負荷均顯著減少，且結腸的縮短程度較Sham組有明顯改善。結腸上皮不典型增生期藥物阻斷MMC情況:治療組肥大細胞數(shù)目明顯較其溶劑對照組減少;治療組血清及結腸組織間液mMCP-1水平均明顯下降;治療組腫瘤數(shù)目、結腸重量顯著減少。15ng/ml mMCP-1可顯著增加腹腔CD11b+Gr-1+細胞的募集。第14周DSCG組小鼠結腸組織、脾臟及腸系