口服復(fù)合蛇毒小鼠血清抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：復(fù)合蛇毒(composite snake venom,CSV)是由多種具有抗腫瘤作用的蛇毒按照一定比例混合所得的制劑。本課題以中藥學(xué)血清藥理學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法，研究口服復(fù)合蛇毒小鼠血清（S-CSV）的腫瘤抑制作用，旨在對(duì)蛇毒制劑口服給藥提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：⑴經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定小鼠口服復(fù)合蛇毒的百分之零死亡的最大劑量（LD0）為68mg/kg，百分之百死亡的最小劑量（LD100）為500mg/kg。按照等比遞增，在68mg

2、/kg—500mg/kg范圍內(nèi)，設(shè)立11個(gè)劑量。取成年健康小鼠144只，每組12只，隨機(jī)分為12組，留備一組，不同劑量組以設(shè)定的濃度分別按0.2ml/10g灌胃，觀察72h內(nèi)小鼠口服不同劑量復(fù)合蛇毒的死亡率，以Bliss法求得小鼠口服復(fù)合蛇毒的半數(shù)致死量（LD50）。⑵健康成年小鼠，雌雄兼用，以1/4 LD50為給藥劑量，灌胃給藥，連續(xù)5d，2次/d，最后一次給藥1.5-2h后，取眼球采血，以常規(guī)方法制備血清，即為口服復(fù)合蛇毒小鼠血清（

3、S-CSV），于-20℃妥善保存?zhèn)溆?。⑶小鼠接種肝癌實(shí)體瘤H22，在無菌條件下，從H22腹水型荷瘤鼠抽取腹水以獲得瘤細(xì)胞懸液，通過離心、稀釋等常規(guī)處理，制備細(xì)胞懸液。取口服復(fù)合蛇毒小鼠血清，與小鼠H22腫瘤細(xì)胞懸液按體積比1:1和1:2配制小鼠含藥血清與H22細(xì)胞混懸液并使其密度為1×106/ml，以相同比例生理鹽水灌胃的未口服復(fù)合蛇毒的小鼠血清為對(duì)照。小鼠按性別隨機(jī)分4組，于右腋下分別接種上述腫瘤細(xì)胞混懸液0.2ml，小鼠常規(guī)飼養(yǎng)10

4、天，觀察不同組小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況，于第11天處死小鼠，記錄小鼠稱重及腫瘤組織重量。⑷人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，常規(guī)培養(yǎng)傳代，消化，離心，稀釋，計(jì)數(shù)，制備細(xì)胞懸液備用。無菌條件下，S-CSV與人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480以1:1體積比配制細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)為1.8×108/ml。以相同比例的未口服復(fù)合蛇毒的小鼠血清及PBS為對(duì)照。各組裸小鼠分別于右腋下接種上述癌細(xì)胞懸液0.2 ml，制成動(dòng)物實(shí)體瘤模型。常規(guī)喂養(yǎng)30天。觀察不同組裸鼠成瘤情況，于第3

5、1天處死裸鼠，記下各瘤組織的重量,拍照，計(jì)算成瘤率。⑸K562細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)傳代，消化，離心稀釋，制備單細(xì)胞懸液，使其密度為5×104/mL，分S-CSV試驗(yàn)組、空白血清組和陰性對(duì)照組。試驗(yàn)組每孔分別加入含32％、16％、8％、4％、2％、1％、0.5％和0.25％S-CSV培養(yǎng)液。每個(gè)濃度復(fù)種4孔。對(duì)照組兩組，空白血清組加等量服用生理鹽水小鼠血清，陰性對(duì)照組加等量培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)6、12、24、36和48小時(shí)，用臺(tái)盼藍(lán)試劑染色。計(jì)數(shù)各

6、組拒染活細(xì)胞數(shù)，每組細(xì)胞最終取均數(shù)值。⑹K562細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)傳代，消化，離心，稀釋，制備單細(xì)胞懸液，使其密度為2×105個(gè)細(xì)胞/ml，分S-CSV試驗(yàn)組和對(duì)照組，對(duì)照組復(fù)種6孔，試驗(yàn)組不同濃度復(fù)種3孔，每孔0.1ml。試驗(yàn)組每孔分別加入含10％、5％、2.5％、1.25％、0.625％的S-CSV的培養(yǎng)液（口服復(fù)合蛇毒小鼠血清與培養(yǎng)液進(jìn)行配比），對(duì)照組按等量的培養(yǎng)液培養(yǎng)，兩組經(jīng)2h、4h、8h、16h、32h時(shí)間后，計(jì)算抑制率（臺(tái)盼藍(lán)

7、排染法）和半數(shù)抑制濃度（IC50）（直線回歸法）。抑制率=（1-藥物組活細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組活細(xì)胞數(shù)）×100％。⑺制備人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)2×105/ml，接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，試驗(yàn)組換成含20%S-CSV的培養(yǎng)液，對(duì)照組為含20%未口服復(fù)合蛇毒小鼠血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)6小時(shí)后，用PBS沖洗三次，吸去PBS，加入適量胰酶消化約2分鐘，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞其凋亡的情況。
　　結(jié)果：①小鼠口服復(fù)合蛇毒的L

8、D50為141mg/kg。②H22細(xì)胞在接種到小鼠之前，分別以33%和50%S-CSV與之共育20-30min，接種10d后小鼠的瘤重分別為1.03±0.53 g和0.70±0.37 g，相比于相應(yīng)的對(duì)照組的瘤重2.81±1.62 g和2.47±1.42 g重量明顯減輕，具有顯著性差異（p<0.001），其抑瘤率分別為63.16%和71.53%。③S-CSV預(yù)處理SW480后接種于裸小鼠，移植瘤的成瘤率為60%（3/5）,腫瘤均重為0.

9、024±0.023g，與對(duì)照血清組(S-C)的80%（4/5）成瘤率，和0.217±0.160g的瘤重相比具有顯著性差異（p<0.001），空白對(duì)照組（PBS）100%（5/5）的成瘤率，0.737±0.220g平均瘤重相比差別極其顯著（p<0.0001）,說明口服復(fù)合蛇毒小鼠血清明顯抑制裸鼠SW480移植瘤的形成和生長(zhǎng)。④運(yùn)用臺(tái)盼藍(lán)排染法計(jì)數(shù)，觀察得S-CSV對(duì)體外培養(yǎng)的K562人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株的細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯抑制作用。0.6

10、25％的口服復(fù)合蛇毒小鼠血清作用16h后即可抑制 K562細(xì)胞生長(zhǎng)。隨著濃度的增加，抑制作用越強(qiáng)，起效越快，呈時(shí)間和劑量依賴性。⑤流式細(xì)胞定量檢測(cè)法觀察S-CSV對(duì)體外培養(yǎng)SW480的作用，發(fā)現(xiàn)S-CSV具有促腫瘤細(xì)胞凋亡作用。經(jīng) S-CSV處理的細(xì)胞凋亡率19.3%，與對(duì)照血清的0.1%相比具有顯著差異，說明口服復(fù)合蛇毒小鼠血清的抗腫瘤活性與其促腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　結(jié)論：口服復(fù)合蛇毒小鼠血清對(duì)小鼠H22移植性實(shí)體瘤及裸鼠SW