廣西眼鏡蛇毒L-氨基酸氧化酶體外抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究從廣西眼鏡蛇毒中分離純化的L-氨基酸氧化酶(LAAO)的體外抗腫瘤作用，并從LAAO與H<,2>O<,2>的聯(lián)系、細(xì)胞凋亡的角度及LAAO對(duì)腫瘤細(xì)胞周期分布的影響等探討LAAO體外抗腫瘤作用的作用機(jī)制。 方法： 1．用DEAE-Sepharose CL-6B離子交換及CM-Sepharose CL-6B離子交換層析法分離純化廣西眼鏡蛇毒中的L-氨基酸氧化酶(LAAO)，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳在還原和非還原

2、條件下測(cè)定其蛋白純度和分子量。 2．采用MTT法及臺(tái)盼藍(lán)拒染法，以生理鹽水(N.S.)為陰性對(duì)照，5-Fu為陽性對(duì)照藥，人肝細(xì)胞株LO2作為正常細(xì)胞對(duì)照，觀察LAAO不同濃度、不同作用時(shí)間對(duì)人慢性髓性白血病細(xì)胞系K562、人肝癌細(xì)胞系Bel-7404及人胃癌細(xì)胞系SGC7901三種人腫瘤細(xì)胞體外增殖的抑制作用。 3．用MTT法檢測(cè)過氧化氫酶對(duì)LAAO及H<,2>O<,2>對(duì)K562細(xì)胞系細(xì)胞毒性作用的影響。 4．

3、用倒置相差顯微鏡、H.E.染色、透射電鏡、TUNEL方法觀察不同濃度LAAO對(duì)K562、Bel-7404及SGC7901三種腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。 5．利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LAAO對(duì)K562、Bel-7404、SGC7901三種人腫瘤細(xì)胞周期分布的影響。 結(jié)果： 1．從廣西眼鏡蛇毒中分離出達(dá)到電泳純的L-氨基酸氧酶，其分子量為55.2KD。 2．LAAO對(duì)K562、Bel-7404、SGC7901三種人腫瘤細(xì)

4、胞及人正常肝細(xì)胞LO2均有細(xì)胞毒性作用，均顯示出良好的量效關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r值均大于0.95(p<0.05)。MTT法檢測(cè)LAAO處理以上三種腫瘤細(xì)胞及正常肝細(xì)胞24h，LAAO的IC50分別為0.6U/ml、3.37U/ml、4.74U/ml和5.85U/ml，LAAO對(duì)正常肝細(xì)胞株LO2毒性與對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性比較，其IC<,50>分別為K562、Bel-7404、SGC7901三種腫瘤細(xì)胞的9.75、1.74、1.23倍。而5-Fu作用

5、于以上三種腫瘤細(xì)胞及正常肝細(xì)胞24h后，其抑制率分別為46.22％、42.99％、41.75％及46.45％。臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)到K562、Bel-7404、SGC7901三種人腫瘤細(xì)胞經(jīng)LAAO處理24、48、72h后，生長(zhǎng)明顯受抑制，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)均隨LAAO作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，濃度效應(yīng)關(guān)系及時(shí)間效應(yīng)關(guān)系顯著，相關(guān)系數(shù)r均大于0.95(p<0.05)。 3．LAAO(1.36U/ml)及H<,2>O<,2>(0.03mM)

6、處理K562細(xì)胞后，細(xì)胞毒性作用明顯(p<0.01)，且兩者的毒性作用相當(dāng)(組間比較p>0.05)，細(xì)胞活率均為6.4％。當(dāng)加入同等劑量的過氧化氫酶(Catalase)分別與上述劑量的H<,2>O<,2>及LAAO共同處理細(xì)胞24h，H<,2>O<,2>+Catalase組細(xì)胞活力完全恢復(fù)；而LAAO+Catalase組細(xì)胞活力并未完全恢復(fù)，而只達(dá)到了78.49％。 4．形態(tài)學(xué)觀察LAAO處理K562、Bel-7404、SGC7

7、901三種人腫瘤細(xì)胞24h后均可見到較多典型的細(xì)胞凋亡表現(xiàn)，隨LAAO濃度的增高各腫瘤細(xì)胞株中凋亡細(xì)胞的數(shù)目增多，TUNEL法半定量檢測(cè)出各細(xì)胞株中低高濃度藥物處理細(xì)胞24h的凋亡指數(shù)(AI)分別為：K562細(xì)胞，15.1％及29.53％；Bel-7404細(xì)胞，29.34％及54.66％；SGC7901細(xì)胞，17.07％及30.57％。 5．LAAO可以使K562細(xì)胞周期阻滯于G<,0>/G<,1>期，并隨藥物濃度的增高阻滯于該

8、期的細(xì)胞比例增多；而對(duì)Bel-7404細(xì)胞，低濃度的LAAO使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期與S期兩個(gè)時(shí)期，高濃度LAAO則使該細(xì)胞周期阻滯于S期；在SGC7901細(xì)胞，LAAO將其細(xì)胞周期阻滯于S期，并隨藥物濃度的增高阻滯于該期的細(xì)胞比例增多。 結(jié)論：從廣西鏡蛇毒中分離純化的L-氨基酸氧化酶(LAAO)，在體外，對(duì)所選用的腫瘤細(xì)胞K562、Bel-7404、SGC7901有明顯的細(xì)胞毒性作用，對(duì)正常細(xì)胞LO2亦有毒性作用，與以上腫