蠶蛹蛋白復合氨基酸的提取及其體外抗肝癌作用的研究.pdf

1、目的：探討蠶蛹蛋白、蠶蛹蛋白復合氨基酸的最佳提取條件，并研究蠶蛹蛋白復合氨基酸在體外對人肝癌細胞的抑制作用。
　　 方法：以柞蠶蛹為原料，石油醚為脫脂溶劑，采用堿溶液浸提法提取蠶蛹蛋白，運用單因素試驗對固液比、浸提時間、溫度3個提取條件進行優(yōu)選。提取出的蠶蛹蛋白經(jīng)雙氧水進行脫色、除臭，得到黃色無臭味蠶蛹蛋白粉，采用凱氏定氮法測定蛋白的含量。將蠶蛹蛋白用胃蛋白酶水解后再經(jīng)酸水解來制取蠶蛹蛋白復合氨基酸。通過單因素試驗探討了酶水解時

2、的底物濃度、pH值、酶濃度、水解溫度及水解時間與水解率的關系，采用正交試驗L16(45)優(yōu)選酶水解的工藝條件。經(jīng)減壓蒸餾、中和、脫色等處理得到黃色澄清的蠶蛹蛋白復合氨基酸。以SMMC-7721細胞株為模型，研究蠶蛹蛋白復合氨基酸體外對人肝癌細胞的抑制作用。經(jīng)MTT法檢測藥物對人正常肝臟細胞株QSG-7701的毒性后，計算藥物安全濃度。將蠶蛹蛋白復合氨基酸配制成濃度為10－3mg/ml、10－2mg/ml、10ˉ1mg/ml、1mg/ml

3、和10mg/ml，分別與人肝癌細胞SMMC-7721共同培養(yǎng)，同時設空白對照組和細胞對照組。每組設5個復孔，每孔加入細胞濃度為4×104個/ml的細胞懸液100ul，分別培養(yǎng)24、48、72h。采用MTT法測定OD值，評定蠶蛹蛋白復合氨基酸對肝癌細胞株的抑制作用；經(jīng)Hoechst33258(10mg/L)染色和倒置顯微鏡進行形態(tài)學觀察以檢測細胞凋亡率；流式細胞法測定細胞周期和Annexin V/PI雙染色法檢測細胞凋亡。
　　

4、結果：以石油醚為脫脂溶劑，提取蠶蛹蛋白的脫脂條件為固液比1:4，溫度50℃，時間4h。重復4次，脫脂率達到96％以上，所得蛋白粉的蛋白含量為83.5％，蛋白回收率為32.59％。胃蛋白酶水解蠶蛹蛋白的最佳酶解工藝條件為：底物濃度為1:5，pH值4.0，酶濃度1.5％，水解溫度60℃，水解時間5h。酶解后再經(jīng)鹽酸水解，其水解率可達到70％左右。所得溶液中氨基酸總量為2.241g/L，其中必需氨基酸含量為0.835g/L，占氨基酸總量的37

5、.26％。細胞毒性實驗表明：蠶蛹蛋白復合氨基酸的最大無毒濃度為10mg/ml。不同濃度的蠶蛹蛋白復合氨基酸作用SMMC-7721細胞24、48和72h后，各用藥組的細胞生長抑制率分別為9.0％～53.5％、12.4％～63.4％和16.8％～70.4％。各組與細胞對照組相比，OD值的差異有顯著性（P＜0.05），并顯示出對劑量和時間的依賴性。作用24、48、72h后，蠶蛹蛋白復合氨基酸對SMMC-7721細胞的IC50分別為4.691m

6、g/ml、1.469mg/ml和0.451mg/ml。Hoechst33258(10mg/L)染色和流式細胞術結果表明，隨著劑量的加大，蠶蛹蛋白復合氨基酸能明顯促進SMMC-7721細胞的凋亡。
　　 結論：蠶蛹蛋白主要是球蛋白，部分溶于水和稀酸中，在堿性溶液中溶解度最大，故堿性溶液浸提法提取蠶蛹蛋白能有效的提高蛋白得率。運用酶水解與酸水解相結合的方法來水解蛋白，同時具有了酶法的所需條件溫和，酶用量少，氨基酸破壞少和酸水解法的水