舟山眼鏡蛇毒細胞毒素CTX1的純化優(yōu)化及其體內(nèi)抗腫瘤作用研究.pdf

1、背景和目的:
　　蛇毒細胞毒素(CardiotoxinsCTXs)又稱心臟毒素或者膜毒素,是眼鏡蛇毒中一類重要的活性成分,約占眼鏡蛇毒總蛋白含量的40％左右,它們的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)是高度保守的。CTX1是由日本學(xué)者Hayashi等從臺灣眼鏡蛇毒中首先分離純化得到的細胞毒素,是分子量為6697.915Da,等電點為9.0的堿性多肽,分子中含有25個疏水氨基酸,并含有較多的亮氨酸、賴氨酸,其中的8個半胱氨酸交聯(lián)成4對二硫鍵。CTX

2、1的分子中的4對二硫鍵聚集成緊密的內(nèi)核像手掌,由此核心區(qū)域伸出的3個緊鄰的富含折疊的指,形成典型的“三指”狀結(jié)構(gòu),“三指”指端為疏水性氨基酸,指側(cè)則帶有正電荷的精氨酸、賴氨酸,這種三指狀結(jié)構(gòu)有利于其與細胞膜結(jié)合,誘導(dǎo)細胞膜脂質(zhì)重新排列,形成孔道,導(dǎo)致細胞的破碎溶解。本課題組曾經(jīng)用兩種不同方法分離純化得到CTX1。周升銘等用CMSepharoseFastFlow陽離子交換層析一步法從舟山眼鏡蛇毒粗毒中分離得到CTX1,但經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)其中尚有

3、一定的雜蛋白,純度有待提高;崔超偉等采用SephadexG-75凝膠過濾、CMSepharoseFastFlow陽離子交換層析兩步法雖從舟山眼鏡蛇毒中純化出了純度較高的CTX1,但耗時較長,對多肽的活性亦有一定的影響。蛇毒細胞毒素因其廣泛的生物學(xué)活性而受到關(guān)注,本課題組前期實驗研究證實蛇毒細胞毒素CTX1對多種腫瘤細胞有明顯的體外殺傷作用,如CTX1能抑制人早幼粒白血病細胞HL-60、人髓性白血病細胞KG1a、人慢性紅白血病細胞K562

4、、人乳腺癌細胞MCF-7、小鼠肝癌細胞H22、小鼠淋巴白血病細胞P388的增殖,而且CTX1對正常細胞毒性作用比較低,如人支氣管上皮細胞16HBE、小鼠骨髓的單個核細胞細胞。其他學(xué)者的體內(nèi)實驗研究也證實蛇毒細胞毒素對多種小鼠移植性腫瘤都有抑制效果。如蛇毒細胞毒素CTX-F對小鼠移植性宮頸癌U14、小鼠移植性艾氏腹水瘤、小鼠移植性S180肉瘤、小鼠移植性P388腹水瘤有抑制作用;蛇毒細胞毒素Ⅻ和蛇毒細胞毒素XIII對小鼠移植性宮頸癌U14

5、、小鼠移植性艾氏腹水瘤有抑制作用;細胞毒素P4在體內(nèi)對B6-F10黑素瘤和軟骨肉瘤有抑制作用。本實驗采用SephadexG-50凝膠層析、CMSepharoseFastFlow陽離子交換層析兩步法對舟山眼鏡蛇毒進行分離純化,通過調(diào)整不同的洗脫流速,以提高其的分離效率及生物活性,為進一步研究CTX1的藥理作用奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。本實驗通過建立P388白血病小鼠腹水瘤模型,來觀察評價CTX1在體內(nèi)的抗腫瘤作用,為將來CTX1的開發(fā)應(yīng)用提供實驗研究

6、的依據(jù)。
　　實驗方法:
　　1.舟山眼鏡蛇毒CTX1的純化優(yōu)化及鑒定
　　1.1.分別用7種不同的流速SephadexG-50凝膠層析初步分離眼鏡蛇毒粗毒。
　　1.2.反相高效液相法分析SephadexG-50凝膠層析分離得到的各洗脫樣品。
　　1.3.用3種不同流速的CMSepharoseFastFlow陽離子交換柱層析法進一步純化SephadexG-50凝膠層析后的相關(guān)樣品。
　　1.4.反相

7、高效液相法分析CMSepharoseFastFlow離子交換層析法分離得到的相關(guān)樣品。
　　2.用P388腹水瘤模型評價CTX1的體內(nèi)抗腫瘤作用
　　2.1.建立小鼠P388腹水瘤模型。
　　2.2.P388腹水瘤小鼠分組尾靜脈注射給藥。
　　2.3.以小鼠的體重、生存期、生命延長率為主要指標評價CTX1的體內(nèi)抗腫瘤作用。
　　2.4.統(tǒng)計學(xué)分析:采用t檢驗、χ2檢驗,SPSS軟件等統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)。

8、>　　實驗結(jié)果:
　　1.運用SephadexG-50凝膠分離、CM-SepharoseFastFlow陽離子交換層析兩步法對舟山眼鏡蛇毒進行分離純化得到純度較高的蛇毒單體CTX1。
　　1.1.用SephadexG-50凝膠分離,流速為1.2、1.8ml/min時從舟山眼鏡蛇毒粗毒中得到2個組分,流速為1.3～1.7ml/min時得到I、II及III3個組分。經(jīng)反相高效液相色譜檢測得知CTX1主要集中在流速1.3～1.7m

9、l/min洗脫峰的II峰里面。
　　1.2.用CMSepharoseFastFlow陽離子交換層析柱分離SephadexG-50凝膠得到的II峰可得到7個組份(II1～II7)。當(dāng)流速為1.4、1.8ml/min時,7個組分之間分離效果較差;當(dāng)流速為1.6ml/min時,各組分的分離效果比較理想。RP-HPLC分析顯示,組分II5峰為單一成分,純度達到94.6%;用內(nèi)標法顯示,組分II5與CTX1標準品在保留時間上完全吻合。所以I

10、I5峰就是CTX1目標峰。
　　2.建立P388腹水瘤模型評價CTX1的體內(nèi)抗腫瘤作用
　　2.1.觀察各組小鼠不同時間的體重變化,造模第1、3、5、7天各實驗組小鼠體重與生理鹽水陰性對照組小鼠體重比較均無統(tǒng)計學(xué)意義;第9、11、13天CTX1(20110202)1/10LD50組、CTX1(20110202)1/5LD50組、CTX1(20130419)1/5LD50組、環(huán)磷酰胺組小鼠體重比生理鹽水陰性對照組要小,差異有統(tǒng)

11、計學(xué)意義,而9、11、13天CTX1(20110202)1/40LD50組、CTX1(20110202)1/20LD50組小鼠體重與生理鹽水組比較無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.2觀察各組小鼠生存時間,與生理鹽水陰性對照組比較,CTX1(20110202)1/40LD50組、CTX1(20110202)1/20LD50組小鼠平均生存時間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。CTX1(20110202)1/10LD50組、CTX1(20110202)1/5L

12、D50組、CTX1(20130419)1/5LD50組、環(huán)磷酰胺組小鼠平均生存時間比生理鹽水陰性對照組要長,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。CTX1樣品(20110202)1/5LD50組小鼠的平均生存時間比CTX1樣品(20110202)1/10LD50組、1/20LD50組、1/40LD50組小鼠的平均生存時間要長,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;CTX1樣品(20110202)1/10LD50組小鼠的平均生存時間比CTX1樣品(20110202)1/20L

13、D50組、1/40LD50組小鼠的平均生存時間要長,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。純度高的CTX1樣品(20130419)1/5LD50組小鼠生存時間比純度低的CTX1樣品(20110202)1/5LD50組要長,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。CTX1樣品(20130419)1/5LD50組、CTX1樣品(20110202)1/5LD50組小鼠的平均生存時間比環(huán)磷酰胺組要長,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.3.觀察各組小鼠的肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù),與生理鹽水

14、陰性對照組比較,CTX1樣品(20110202)1/5LD50組、CTX1樣品(20130419)1/5LD50組小鼠的肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。環(huán)磷酰胺組小鼠的肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)均比生理鹽水陰性對照組CTX1樣品(20110202)1/5LD50組、CTX1樣品(20130419)1/5LD50組都要小,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.舟山眼鏡蛇原毒通過SephadexG-50凝膠層析,流速為1.6m