羧甲基裂褶多糖抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的： 隨著惡性腫瘤的發(fā)生率不斷上升，惡性腫瘤已成為急待人類攻克的重大課題。目前，對(duì)惡性腫瘤的治療，除手術(shù)、放療和化療三大治療手段外，以免疫治療為代表的腫瘤生物治療已成為重要的腫瘤輔助治療方法[1]。正常人的免疫系統(tǒng)能識(shí)別和殺死惡性腫瘤細(xì)胞，免疫防護(hù)能力差或?qū)Σ徽＜?xì)胞識(shí)別能力差，均能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生率增高。因此，免疫刺激劑和免疫調(diào)節(jié)劑被認(rèn)為是潛在的抗癌劑[2]。 多糖類就是一種重要的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。多糖做為一種免疫

2、促進(jìn)劑不僅能夠促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的免疫功能。還能促進(jìn)細(xì)胞因子的合成或提高免疫細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子的敏感性。可用于治療癌癥，并無骨髓抑制等毒性[3]。植物多糖可通過對(duì)荷瘤機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用達(dá)到抗腫瘤的效果已得到世界的公認(rèn)。 裂褶菌胞外多糖(Schizophyllan，SPG)是由藥用真菌裂褶菌(SchizophyllumcommuneFries)深層發(fā)酵產(chǎn)生的一種中性的胞外多糖，具有β-(1-6)葡萄糖苷分支的β-(

3、1-3)-D葡聚糖結(jié)構(gòu)，主鏈上每隔3個(gè)葡萄糖單元產(chǎn)生一個(gè)分支。它具有良好的抗腫瘤活性[5]。裂褶多糖(SPG)作為一種免疫功能調(diào)節(jié)劑，主要是通過增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能以殺死或抑制腫瘤細(xì)胞。國(guó)內(nèi)外對(duì)其免疫作用機(jī)制的研究有不少報(bào)道[6]。如在體外，10-100μg/mL劑量的SPG能提高刀豆素A誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。拮抗免疫抑制劑氫化可的松對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，增加脾淋巴細(xì)胞抗羊紅細(xì)胞抗體的數(shù)量，并能增加遲發(fā)型皮膚過敏反應(yīng)，提高細(xì)胞免疫

4、功能。對(duì)于實(shí)驗(yàn)小鼠，裂褶多糖對(duì)S-180的腹水瘤和實(shí)體瘤、Lewis肺癌等表現(xiàn)出抑瘤活性[7-8]。 多糖的免疫活性受多方面因素的影響，包括溶解性、分子量、化學(xué)結(jié)構(gòu)、給藥途徑和劑量、提取方法以及受藥動(dòng)物種類等[9]。裂褶多糖已被證明具有良好的抗腫瘤、抗感染，提高免疫力等作用。但國(guó)內(nèi)生產(chǎn)裂褶多糖產(chǎn)品存在著可溶性差，分子量大，效果不肯定等問題。為了提高多糖的免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)多糖進(jìn)行改性可能會(huì)產(chǎn)生一些新的理化性質(zhì)，有利于對(duì)構(gòu)效關(guān)系的闡

5、述，增加其抗腫瘤療效，是目前多糖研究的熱點(diǎn)之一，現(xiàn)已應(yīng)用多種改性方法，并取得大的進(jìn)展[4]。羧甲基化作為一種常見的化學(xué)反應(yīng)在淀粉、纖維素等高分子材料的改性中得到了廣泛的應(yīng)用。近年的研究表明[10]，制備一定取代度的羧甲基化多糖往往能夠起到增強(qiáng)抗腫瘤活性的作用。 本研究首次將較大分子量的裂褶多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行羧甲基化的不同取代度的改性，使其分子量較小，水溶性好，黏度低，易于制成各種劑型，給藥方便，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，希望通過改性

6、提高其抗腫瘤效果，為開發(fā)新型抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。 方法： 1.制備羧甲基化裂褶多糖，使用凝膠過濾法測(cè)定其分子量。 2.用BLCB/C小鼠采用腹腔種植法建立肝癌模型，設(shè)立陰性對(duì)照組(NS)、陽(yáng)性對(duì)照組(5-Fu)、裂褶多糖組(SPG)、兩種不同取代度的羧甲基裂褶多糖組(CM-SPG1、CM-SPG2)。以給藥后瘤體大小、瘤重、抑瘤率、組織病理學(xué)檢查等指標(biāo)評(píng)價(jià)改性前后的裂褶多糖作用于荷瘤小鼠的效果。 3.

7、以鼠肝癌細(xì)胞株H22和人肺癌細(xì)胞株GLC-82為對(duì)象，設(shè)立陰性對(duì)照(NS)組、陽(yáng)性對(duì)照組(DDP)、裂褶多糖組(SlaG)、兩種不同取代度的羧甲基裂褶多糖組(CM-SPG1、CM-SPG2)。依據(jù)臺(tái)盼藍(lán)拒染法和四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)操作，以細(xì)胞死亡率和OD值評(píng)價(jià)改性前后裂褶多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞是否具有細(xì)胞毒作用。 4.肝癌荷瘤小鼠分成4組，設(shè)空白對(duì)照組(NS組)、陽(yáng)性對(duì)照組(CY組)裂褶多糖組(SPG)和羧甲基化裂

8、褶多糖給藥組(CM-SPG1組)。處死前摘眼球取血分離上清，采用放射免疫法測(cè)量血清TNF-α、IL-2含量。操作按說明書進(jìn)行。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，實(shí)際數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示；(1)荷瘤小鼠不同藥物組的瘤重比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)。組間兩兩比較采用LSD法(或SNK法)。p<0.05時(shí)認(rèn)為存在顯著差異。(2)不同時(shí)間、不同藥物的OD值比較采用4×3析因方差分析(F

9、actorialanalysis)。p<0.05時(shí)認(rèn)為存在顯著差異。(3)不同時(shí)間、不同藥物的細(xì)胞死亡率采用多組率之間的X2檢驗(yàn)(Chi-SquareTest)。p<0.05時(shí)認(rèn)為存在顯著差異。(4)不同組間血清含量測(cè)定采用單因素方差分析(One-WayANOVA)。組間兩兩比較采用LSD法(或SNK法)。p<0.05時(shí)認(rèn)為存在顯著差異。 結(jié)果： 1.羧甲基裂褶多糖分子量為1×105Da。 2.荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果

10、 (1)小鼠瘤重各組瘤重有顯著性差異(p<0.05)；SPG組與CM-SPG1、CM-SPG2表現(xiàn)出顯著性差異(p(0.05)，改性前與改性后的兩種取代度裂褶多糖存在顯著性差異，改性后瘤重小于改性前瘤重，認(rèn)為改性后抗腫瘤作用提高；CM-SPG1和CM-SPG2組無顯著性差異(p>0.05)，兩種不同取代度的羧甲基裂褶多糖的抑瘤作用無顯著性差異。 (2)各組抑制率從大到小依次為：5-Fu、CM-SPG1、CM-SPG2、SP

11、G。 (3)組織病理學(xué)各組腫瘤組織形態(tài)相似，均為低分化癌，并浸潤(rùn)骨骼肌組織，都可見凝固性壞死。SPG組和CM_SPG-1組腫瘤細(xì)胞相對(duì)致密，5-Fu組腫瘤細(xì)胞相對(duì)疏松，染色淺；凝固性壞死區(qū)占比例5-Fu組最大，SPG組次之，CM-SPG-1組最小；凋亡細(xì)胞數(shù)目5-Fu組最多，CM-SPG-1組次之，SPG組最少；空泡狀細(xì)胞5-Fu組和CM-SPG-1組都較多，SPG最少；淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)結(jié)締組織見于SPG組和CM-SPG-

12、1組，5-Fu組不明顯。 3.CM-SPG體外作用于肝癌細(xì)胞株H22的臺(tái)盼藍(lán)拒染法所測(cè)得的細(xì)胞死亡率進(jìn)行X2檢驗(yàn)各組存在顯著性差異(p<0.05)。DDP組死亡率顯著高于各組。SPG、CM-SPG1、CM-SPG2、NS組死亡率無顯著差異(p>0.05)。認(rèn)為改性前后的裂褶多糖在體外均末對(duì)肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出抑制作用，無細(xì)胞毒作用。 4.CM-SPG體外作用于肺癌細(xì)胞株GLC-82的MTT所測(cè)的OD值進(jìn)行析因分析，認(rèn)為各給藥組

13、和DDP對(duì)照組有顯著性差異(p<0.05)。與生理鹽水給比較各給藥組之間無顯著性差異(p>0.05)，改性前和改性后裂褶多糖在體外對(duì)肺癌細(xì)胞無抑制作用，無細(xì)胞毒作用。 5.血清TNF-α、IL-2含量各組含量有顯著性差異(p<0.05)；SPG、CM-SPG1組含量顯著高于NS組及CY組，CY組顯著低于NS組。CM-SPG1組與SPG組含量存在顯著性差異(P<0.05)，CM-SPG1含量高于SPG組。改性后裂褶多糖較改性前免疫