RSV感染A549細(xì)胞趨化因子RANTES、FKN、IP-10表達(dá)的變化及PPARγ激動(dòng)劑的調(diào)控作用.pdf

1、目的：
　　 1.研究呼吸道合胞病毒(RSV)感染人肺癌腺上皮細(xì)胞(A549)在三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)(12h、24h、48h)后調(diào)節(jié)激活正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌細(xì)胞因子(RANTES)、分形趨化因子(FKN)、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（IP-10）mRNA和蛋白水平的變化，探討RSV感染后趨化因子表達(dá)的變化。
　　 2.通過(guò)不同濃度過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)激動(dòng)劑15-脫氧前列腺素J2(15d-PGJ2)和羅格列酮及P

2、PARγ拮抗劑(GW9662)對(duì)RSV感染A549細(xì)胞的干預(yù)，研究不同時(shí)間點(diǎn)RANTES，F(xiàn)KN，IP-10mRNA表達(dá)和蛋白水平的變化，分析天然和合成PPARγ激動(dòng)劑對(duì)RSV感染趨化因子表達(dá)的影響。
　　 3.為臨床應(yīng)用PPARγ激動(dòng)劑治療RSV感染提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為RSV感染的治療及藥物的研發(fā)提供新的途徑。
　　 方法：
　　 1.建立體外模型:將傳代培養(yǎng)的A549細(xì)胞鋪于六孔板中，每孔加入相同劑量的F12K培

3、養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜。將細(xì)胞隨機(jī)分成5組:A組（15d-PGJ2+RSV組），B組（羅格列酮+RSV組）、C組（DMSO+RSV組）、D組（GW9662+羅格列酮+RSV組）、E組（細(xì)胞對(duì)照組）。A組、B組和C組先分別以10-20μmol/L的15d-PGJ2、10-30μmol/L的羅格列酮和0.01％(v/v) DMSO預(yù)處理0.5h，再加100半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID50)RSV吸附2h后加培養(yǎng)液37℃、5％CO2培養(yǎng);D組先以10μ

4、mol/L的GW9662預(yù)處理0.5h，再加10μmol/L的羅格列酮作用2h后以100TCID50 RSV吸附2h，然后加培養(yǎng)液培養(yǎng);E組未予處理在培養(yǎng)液中正常培養(yǎng)。各組分別在培養(yǎng)12h、24h、48h收獲細(xì)胞及上清液待測(cè)。
　　 2.應(yīng)用ELISA檢測(cè)各組上清液RANTES、FKN、IP-10蛋白水平，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)各組RANTES、FKN、IP-10 mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.病

5、毒滴度的測(cè)定:本次實(shí)驗(yàn)RSV的TCID50通過(guò)Reed-Muench公式計(jì)算為10-5.6/50μl。造模采用的病毒攻擊量為100TCID50，即10-3.6/50μl。
　　 2.RSV感染后RANTES、FKN、IP-10蛋白水平和mRNA表達(dá)的變化與E組相比，C組RANTES、FKN、IP-10蛋白及mRNA表達(dá)在12h、24h和48h均明顯升高（均P＜0.01）。其中RANTES、FKN、IP-10的蛋白表達(dá)量均在48h

6、達(dá)高峰，與12h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）;而三種因子mRNA的表達(dá)量在24h達(dá)高峰，48h有所下降，與12h的表達(dá)量相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(均P＞0.05)。RANTES、FKN、IP-10蛋白和mRNA隨時(shí)間的變化趨勢(shì)基本一致。
　　 3.PPARγ激動(dòng)劑干預(yù)對(duì)RANTES蛋白和mRNA表達(dá)的影響:
　　 在12h、24h、48h三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)上，不同濃度的15d-PGJ2和羅格列酮干預(yù)后，對(duì)RANTESm

7、RNA和蛋白表達(dá)的抑制作用在12h最強(qiáng)，與24h及48h相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。在同一時(shí)間點(diǎn)上，不同濃度的15d-PGJ2和羅格列酮隨著藥物劑量的增加，RANTESmRNA和蛋白的表達(dá)量均呈劑量依賴性下降，與C組相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，但仍高于E組，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中20μmol/L15d-PGJ2和30μmol/L羅格列酮干預(yù)后RANTES mRNA和蛋白的表達(dá)量最低。C組

8、與D組相比，RANTES mRNA和蛋白表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。
　　 4.PPARγ激動(dòng)劑干預(yù)對(duì)FKN蛋白和mRNA和表達(dá)的影響:
　　 同一時(shí)間點(diǎn)，A組、B組與C組相比，隨著藥物劑量的增加，F(xiàn)KNmRNA和蛋白的表達(dá)量均呈劑量依賴性下降(均P＜0.05)。其中20μmol/L15d-PGJ2和30μmol/L羅格列酮干預(yù)后FKNmRNA和蛋白的表達(dá)量最低。但A組、B組與E組相比，仍明顯升高，差異亦

9、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。在三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)上，各個(gè)濃度的15d-PGJ2和羅格列酮對(duì)FKN mRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用在12h最強(qiáng)，與24h及48h相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。C組與D組相比，F(xiàn)KNmRNA和蛋白表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。
　　 5.PPARγ激動(dòng)劑干預(yù)對(duì)IP-10蛋白和mRNA和表達(dá)的影響:
　　 各個(gè)濃度的15d-PGJ2和羅格列酮對(duì)IP-10mRNA和蛋白表達(dá)的

10、抑制作用在12h最強(qiáng)，與24h及48h相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。同一時(shí)間點(diǎn)，隨著藥物劑量的增加，A組和B組的IP-10mRNA和蛋白的表達(dá)量均呈劑量依賴性下降，其中20μmol/L15d-PGJ2和30μmol/L羅格列酮干預(yù)后IP-10mRNA和蛋白的表達(dá)量最低，與C組相比差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）;但仍高于E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。C組與D組相比，IP-10mRNA和蛋白表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)

11、學(xué)意義(均P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.RSV感染可導(dǎo)致趨化因子RANTES、FKN和IP-10mRNA水平及蛋白表達(dá)升高，表明RSV感染可上調(diào)趨化因子的表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。
　　 2.15d-PGJ2、羅格列酮均可降低RSV感染A549細(xì)胞中不同時(shí)間點(diǎn)RANTES、FKN和IP-10mRNA及蛋白的表達(dá)，而使用GW抑制劑之后，三種趨化因子的表達(dá)與RSV組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明PPARγ激動(dòng)劑具有下