急性肝衰竭小鼠腸黏膜通透性變化機(jī)制及微生態(tài)制劑的保護(hù)作用.pdf

1、目的:肝衰竭是指由多種因素引起的嚴(yán)重肝臟損害，導(dǎo)致肝臟本身合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙或失代償，臨床上出現(xiàn)以凝血機(jī)制障礙、黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組癥候群[1]。關(guān)于肝衰竭的發(fā)病機(jī)理目前尚不十分清楚。近年來(lái)，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為本病的發(fā)生主要是免疫損傷，缺血缺氧，內(nèi)毒素血癥三重致死性打擊的結(jié)果[2]。肝衰竭時(shí)存在嚴(yán)重的內(nèi)毒素血癥，內(nèi)毒素及其下游產(chǎn)物腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TN

2、F-α)、白介素-6、NO等炎性細(xì)胞因子的異常升高，一方面可以導(dǎo)致大量肝細(xì)胞壞死或凋亡，亦能通過(guò)某種機(jī)制影響或是破壞了腸黏膜屏障功能，導(dǎo)致腸黏膜通透性增高，從而使得一些大分子物質(zhì)、細(xì)菌及其毒素均可以隨意通過(guò)腸黏膜屏障，并且與自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎、肝性腦病等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)。因此本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)BALB/c小鼠腹腔注射D-氨基半乳糖建立急性肝衰竭小鼠(acute liverfailure，ALF)模型，并應(yīng)用微生態(tài)制劑—雙歧桿菌乳桿菌

3、三聯(lián)活菌（金雙歧）灌胃干預(yù)，研究急性肝衰竭小鼠回腸ZO-1蛋白表達(dá)情況及其與血清TNF-α、血漿內(nèi)毒素水平等的關(guān)系，以探討ALF腸黏膜通透性升高的可能機(jī)制以及微生態(tài)制劑的保護(hù)作用。
　　方法:選用健康清潔級(jí)6-8周齡雄性BALB/c小鼠30只，體重18-22g。30只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分成正常對(duì)照組、急性肝衰竭組和金雙歧干預(yù)組（簡(jiǎn)稱干預(yù)組），每組各10只。所有小鼠均標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度18-22℃，相對(duì)濕度(60.0±10.0

4、)％。正常對(duì)照組及急性肝衰竭組小鼠給予生理鹽水（9ml/kg/d）灌胃，干預(yù)組給予雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌（900mg/kg/d，生理鹽水配成100mg/ml混懸液）灌胃，每日一次，兩周后急性肝衰竭組和干預(yù)組一次性腹腔注射D-氨基半乳糖（3.0g/kg，以生理鹽水溶解，濃度為60mg/ml），正常對(duì)照組腹腔注射等體積生理鹽水。注射后9h以10％水合氯醛腹腔注射麻醉，摘眼球法處死小鼠，留取血清、血漿、肝組織及回腸組織。應(yīng)用日本OLYMPUS

5、 AU-2700全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）;酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清TNF-α水平;應(yīng)用鱟試劑顯色基質(zhì)法測(cè)定血漿內(nèi)毒素水平;取部分肝組織固定于10％福爾馬林溶液，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片并進(jìn)行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察肝組織的普通病理學(xué)改變;實(shí)時(shí)

6、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time quantitative polymerase chainreaction，RT-qPCR)檢測(cè)肝組織TNF-α mRNA及回腸組織ZO-1 mRNA的表達(dá);Western blot檢測(cè)回腸ZO-1蛋白的表達(dá)。采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。數(shù)據(jù)分析前進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)。滿足正態(tài)且方差齊時(shí)，采用單因素方差分析，組間比較采用Student

7、-Newman-Keuls法。非正態(tài)或方差不齊時(shí)，采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1小鼠的一般情況
　　正常對(duì)照組小鼠毛發(fā)有光澤，精神狀態(tài)好，飲食量多，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏;急性肝衰竭組小鼠毛發(fā)凌亂沒(méi)有光澤，飲食量明顯減少，活動(dòng)減少，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍;干預(yù)組小鼠上述表

8、現(xiàn)介于正常對(duì)照組與急性肝衰竭組之間。
　　2肝組織病理學(xué)變化
　　HE染色示:正常對(duì)照組:肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，以中央靜脈為軸，肝細(xì)胞索呈放射狀排列，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，大小均勻，無(wú)變性及壞死，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn);急性肝衰竭組:肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞索消失，可見(jiàn)多處出血壞死灶，并有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn);干預(yù)組:肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，細(xì)胞排列較整齊，僅見(jiàn)輕度細(xì)胞水腫，小葉中央?yún)^(qū)僅有少量點(diǎn)狀壞死，變性、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的程度均較急性肝衰竭組顯著改善。

9、
　　3各組小鼠血清ALT、AST、TNF-α及血漿內(nèi)毒素水平變化
　　急性肝衰竭組小鼠血清ALT（393.587±31.010）、AST(475.751±41.536)、TNF-α(435.971±30.415)及血漿內(nèi)毒素（3.789±0.313）水平均高于正常對(duì)照組（38.994±9.628、55.279±7.500、51.602±8.540、0.577±0.120），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）;干預(yù)組上述

10、各指標(biāo)(158.271±23.637、259.216±22.492、256.289±26.221、2.716±0.214)均較急性肝衰竭組明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）。
　　4肝組織TNF-α mRNA及回腸組織ZO-1 mRNA表達(dá)變化
　　急性肝衰竭組小鼠肝組織TNF-α mRNA表達(dá)（3.355±0.274）明顯高于正常對(duì)照組(1.00)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);并且，干預(yù)組小鼠肝組織T

11、NF-α mRNA表達(dá)(2.284±0.212)較急性肝衰竭組明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　急性肝衰竭組小鼠回腸ZO-1 mRNA表達(dá)(0.441±0.046)明顯低于正常對(duì)照組(1.00)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;干預(yù)組小鼠回腸ZO-1mRNA表達(dá)（0.680±0.039）較急性肝衰竭組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　5回腸組織ZO-1蛋白水平
　　急性肝衰竭組小

12、鼠回腸ZO-1蛋白表達(dá)(0.361±0.037)明顯低于正常對(duì)照組（0.808±0.069），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);干預(yù)組小鼠回腸ZO-1蛋白表達(dá)（0.552±0.055）較急性肝衰竭組明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　6 ZO-1蛋白與血清TNF-α、血漿內(nèi)毒素水平的相關(guān)性分析
　　各組小鼠回腸ZO-1蛋白的表達(dá)與血清TNF-α、血漿內(nèi)毒素水平均呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=-0.946，-0

13、.919（P值均＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1腹腔注射D-氨基半乳糖能夠成功建立急性肝衰竭小鼠模型，血清TNF-α和血漿內(nèi)毒素在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮不可或缺的作用。
　　2急性肝衰竭小鼠回腸ZO-1 mRNA/蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組明顯下降，且ZO-1蛋白的表達(dá)量與血清TNF-α水平之間存在相關(guān)性，TNF-α通過(guò)抑制回腸ZO-1 mRNA的表達(dá)進(jìn)而下調(diào)ZO-1蛋白的表達(dá)，破壞腸黏膜上皮細(xì)胞間的緊密連接，可能是TNF-α導(dǎo)