TLR4-PI3K信號通路在大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎中的作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 TLR4對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞分泌IL-1β、 TNF-α的影響
　　目的:研究Toll樣受體-4(Toll like receptors4，TLR4)對脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α的影響，探討TLR4在顳下頜關(guān)節(jié)病發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法:無菌條件下取大鼠顳下頜

2、關(guān)節(jié)滑膜組織，采用酶消化法獲取原代滑膜細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測波形蛋白(vimentin)和CD68的表達(dá)。以終濃度為0，0.1，1，10，100ng/mL的LPS刺激滑膜成纖維細(xì)胞24h，或以LPS(終濃度100ng/mL)刺激細(xì)胞0，1，6，12，24h，檢測LPS刺激與IL-1β、TNF-α表達(dá)的量效和時(shí)效性關(guān)系，選擇最佳的刺激濃度與時(shí)間。應(yīng)用LPS刺激細(xì)胞，Western

3、 blot檢測TLR4、MyD88的表達(dá)變化，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNF-α的表達(dá)情況，應(yīng)用Realtime PCR檢測TLR4、MyD88、IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)變化。用TLR4的特異性抑制劑TAK-242預(yù)處理滑膜成纖維細(xì)胞后，再加入LPS刺激細(xì)胞，應(yīng)用Realtime PCR檢測IL-1β、TNF-α

4、 mRNA的表達(dá)變化，采用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNF-α的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞外形均勻一致，具有成纖維細(xì)胞的形態(tài)，所有培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞均對CD68蛋白表達(dá)陰性，vimentin表達(dá)陽性。證實(shí)該細(xì)胞是滑膜成纖維細(xì)胞。經(jīng)LPS刺激后，IL-1β、TNF-α mRNA及蛋白表達(dá)量升高，并且隨著LPS刺激濃度的增加而逐漸升高。同時(shí)，呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴關(guān)系，IL-1β、TNF-α表達(dá)量在

5、12h到達(dá)高峰，IL-1β、TNF-α mRNA在6h到達(dá)高峰。LPS能夠明顯增強(qiáng)TLR4、MyD88、IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白表達(dá)，TAK-242的應(yīng)用能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞IL-1β、TNF-α mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:TLR4在LPS誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α過程中起到重要的調(diào)控作用，特異性抑制劑TAK-242可以有效地抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1β、TNF-α mRNA及

6、蛋白的表達(dá)。TLR4可能參與了顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的發(fā)生發(fā)展過程。
　　第二部分 TLR4在PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α中的作用研究
　　目的:探討PI3K/Akt信號通路對顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞IL-1β、TNF-α的表達(dá)調(diào)控過程，研究TLR4對PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)SFs表達(dá)IL-1β、TNF-α的影響。
　　方法:體外培養(yǎng)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞，應(yīng)用LPS刺激

7、細(xì)胞，Western blot檢測PI3K、Akt、P-PI3K、P-Akt的表達(dá)變化，采用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNF-α的表達(dá)情況，應(yīng)用Realtime PCR檢測IL-1β、TNF-αmRNA的表達(dá)變化。用PI3K的特異性抑制劑LY294002預(yù)處理滑膜成纖維細(xì)胞后，再加入LPS刺激細(xì)胞，應(yīng)用Real time PCR檢測IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)變化，采用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、

8、TNF-α的表達(dá)情況。用TLR4的特異性抑制劑TAK-242預(yù)處理滑膜成纖維細(xì)胞后，再加入LPS刺激細(xì)胞，Western blot檢測P-PI3K的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:經(jīng)LPS刺激后，與對照組相比，P-PI3K、P-Akt、IL-ββ、TNF-α的表達(dá)量顯著升高。LY294002的應(yīng)用能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞IL-1β、TNF-α mRNA及蛋白的表達(dá)。TAK-242的應(yīng)用能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞P-PI

9、3K的表達(dá)。
　　結(jié)論:PI3K/Akt信號通路在顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞IL-1β、TNF-α的表達(dá)調(diào)控過程中起著重要作用。特異性抑制劑LY294002可以有效地抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1β、TNF-α mRNA及蛋白的表達(dá)。TLR4對PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)SFs表達(dá)IL-1β、TNF-α有著重要作用。PI3K/Akt信號通路可能參與了顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的發(fā)生發(fā)展過程。
　　第三部分 TLR4在調(diào)節(jié)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎癥

10、反應(yīng)中的作用
　　目的:研究TLR4在調(diào)節(jié)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)中的作用，探討TLR4在顳下頜關(guān)節(jié)病發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法:采用四種方法建立顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎動物模型，咬肌切除組:切除大鼠雙側(cè)咬肌;咬合干擾組:右下第一磨牙粘接鑄造金屬冠;咬合升高組:粘接上頜磨牙牙合墊;咬肌切除加咬合升高組:切除雙側(cè)咬肌并粘接上頜磨牙牙合墊。通過觀察大鼠滑膜組織的病理學(xué)改變選擇一種穩(wěn)定而有效的建模方法。建立大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎模型后，

11、免疫組織化學(xué)染色檢測滑膜組織中TLR4、MyD88、IL-1β、TNF-α的表達(dá)變化，應(yīng)用Realtime PCR檢測滑膜組織中TLR4、MyD88、IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)變化。在大鼠雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射TLR4的特異性抑制劑TAK-242，應(yīng)用HE染色觀察滑膜組織的炎癥反應(yīng)。免疫組織化學(xué)染色檢測滑膜組織中IL-1β、TNF-α的表達(dá)變化，應(yīng)用Realtime PCR檢測滑膜組織中IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)

12、變化。
　　結(jié)果:HE染色圖片顯示咬肌切除加咬合升高組出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，其病理學(xué)評分與其他三個實(shí)驗(yàn)組相比有顯著差異。采用切除雙側(cè)咬肌并粘接上頜磨牙牙合墊的方法建立滑膜炎模型，模型組滑膜組織出現(xiàn)TLR4、MyD88、IL-1β、TNF-α蛋白及mRNA的表達(dá)升高。TAK-242的應(yīng)用可以緩解滑膜組織的炎癥反應(yīng)，并且使IL-1β、TNF-α蛋白及mRNA的相對表達(dá)量顯著下降。
　　結(jié)論:TLR4在大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)中起

13、到重要的調(diào)控作用，特異性抑制劑TAK-242可以有效地抑制滑膜炎發(fā)病過程中出現(xiàn)的IL-ββ、TNF-αmRNA及蛋白的表達(dá)。TLR4可能參與了顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的發(fā)生發(fā)展過程。
　　第四部分TLR4在PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)中的作用
　　目的:探討PI3K/Akt信號通路在調(diào)節(jié)顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎中的作用，研究TLR4在PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)過程中的作用及意義。
　　

14、方法:采用切除雙側(cè)咬肌并粘接上頜磨牙牙合墊的方法建立滑膜炎模型，免疫組織化學(xué)染色檢測滑膜組織中P-PI3K、P-Akt、IL-1β、TNF-α的表達(dá)變化，在大鼠雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PI3K的特異性抑制劑LY294002，應(yīng)用HE染色觀察滑膜組織的炎癥反應(yīng)變化。免疫組織化學(xué)染色檢測滑膜組織中IL-1β、TNF-α的表達(dá)變化，應(yīng)用Realtime PCR檢測滑膜組織中IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)變化。在大鼠雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射

15、TLR4的特異性抑制劑TAK-242，免疫組織化學(xué)染色檢測滑膜組織中P-PI3K的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:采用切除雙側(cè)咬肌并粘接上頜磨牙牙合墊的方法建立滑膜炎模型，模型組滑膜組織出現(xiàn)P-PI3K、P-Akt蛋白表達(dá)升高。LY294002的應(yīng)用可以緩解滑膜組織的炎癥反應(yīng)，并且使IL-1β、TNF-α蛋白及mRNA的相對表達(dá)量顯著下降。TAK-242的應(yīng)用能顯著抑制滑膜組織P-PI3K的表達(dá)。
　　結(jié)論:PI3K/Akt信號通路在