白芍總苷對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和IL-23表達(dá)的影響.pdf

1、背景：
　　 銀屑病是一種常見的由多基因遺傳決定的、多環(huán)境因素刺激誘導(dǎo)的慢性炎癥性增殖性皮膚病，其病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。目前銀屑病發(fā)病的始動(dòng)觸發(fā)因素仍然不清楚，其發(fā)病機(jī)制涉及到免疫系統(tǒng)紊亂、血管新生和角質(zhì)形成細(xì)胞增生等多個(gè)環(huán)節(jié)。其組織病理學(xué)最主要的特征是角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte，KC)過(guò)度增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、新生血管形成。在銀屑病的組織病理變化中真皮乳頭血管的異常最先發(fā)生，而后出現(xiàn)炎癥細(xì)胞的移行和表皮增生

2、及分化異常。同時(shí)，大量的免疫活性細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子滲出到血管外的組織中，誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞活化、增殖并分泌大量細(xì)胞因子，由此形成細(xì)胞因子相互調(diào)控的惡性循環(huán)，促進(jìn)疾病的進(jìn)展。
　　 在銀屑病病理過(guò)程中，由表皮細(xì)胞分泌的很多血管源性細(xì)胞因子參與了血管增生，但以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)最為重要。銀屑病皮損中的KC是促進(jìn)血管新生細(xì)胞因子的主要來(lái)源。研究表明，VE

3、GF mRNA及蛋白表達(dá)水平在銀屑病患者皮損中明顯增加，患者非皮損處VEGFmRNA及蛋白水平表達(dá)亦增加，許多研究又表明嚴(yán)重類型的銀屑病患者血清中VEGF水平也顯著升高，且與疾病的活動(dòng)有一定相關(guān)性。另有報(bào)道將編碼VEGF的基因轉(zhuǎn)入小鼠皮膚可致銀屑病樣改變，并出現(xiàn)特征性的Koebner現(xiàn)象，這進(jìn)一步說(shuō)明VEGF在銀屑病發(fā)病過(guò)程中起到重要作用。同時(shí)，銀屑病也是多種炎細(xì)胞共同參與的免疫性疾病。IL-23是新近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，是由本身無(wú)生物

4、活性的p19因子與IL-12的p40亞基通過(guò)二硫鍵相連組成的異二聚體。能夠誘導(dǎo)記憶性T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，具有較強(qiáng)的抗感染免疫保護(hù)功能和抗腫瘤活性。研究表明銀屑病病人皮損IL-23的表達(dá)明顯增高。Piskin等發(fā)現(xiàn)UVB治療銀屑病后，臨床癥狀得到改善，局部皮損IL-23的表達(dá)也下調(diào)。因此他們推測(cè)，角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)表達(dá)IL-23可能對(duì)銀屑病的炎性過(guò)程起一定作用。
　　 白芍總苷膠囊(商品名帕夫林，total glucosides o

5、f paeony，TGP)是從中藥白芍中提取的復(fù)合制劑，主要成分包括芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷、苯甲酰芍藥苷等，其中芍藥苷占總苷量的90％，是白芍的主要有效成分。其藥理作用主要有抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能、影響細(xì)胞增殖、止痛、保肝等作用。TGP對(duì)自身免疫過(guò)程中的多個(gè)環(huán)節(jié)都存在著調(diào)節(jié)作用。研究報(bào)道TGP可以抑制VEGF、金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)等活性物質(zhì)的產(chǎn)生。目前國(guó)內(nèi)對(duì)TGP治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、兒童特發(fā)性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的研究較多，但

6、對(duì)TGP治療銀屑病的機(jī)制尚不清楚。
　　 促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重要的信號(hào)通路，能將多種細(xì)胞外刺激產(chǎn)生的信號(hào)通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)從細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞分化、增殖、凋亡、應(yīng)激、炎癥以及免疫反應(yīng)等多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。其任一環(huán)節(jié)的異常都可能導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖與分化。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括MAPK激酶激酶(

7、MAPK kinase kinase，MAPKKK)、MAPK激酶(MAPK kinase，MAPKK)、MAPK，此通路主要為三級(jí)酶聯(lián)反應(yīng)模式：激活因子作用于MAPKKK使其首先被激活，MAPKKK被激活后又能使MAPKK磷酸化而被激活，產(chǎn)生MAPK并激活一系列其它蛋白激酶，使細(xì)胞骨架成分磷酸化，亦可經(jīng)核轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核激活核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的靶基因，完成對(duì)細(xì)胞刺激的反應(yīng)。細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素以及各種應(yīng)激刺激都可以作為激活因

8、子激活這個(gè)三級(jí)酶聯(lián)反應(yīng)。MAPK是MAPK途徑的核心，其底物絕大部分是核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子。MAPKs主要包括3個(gè)經(jīng)典的亞家族途徑，即細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulatedkinase1/2，ERK1/2)，p38 MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinases，J

9、NK)。p38是MAPK的亞類之一，主要被炎性細(xì)胞因子和環(huán)境應(yīng)激刺激而激活。p38的激活和炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6的產(chǎn)生關(guān)系密切，并在角質(zhì)形成細(xì)胞的增生和分化中發(fā)揮重要作用。已有研究表明p38MAPK途徑在銀屑病的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有報(bào)道TGP可通過(guò)激活p38MAPK，調(diào)節(jié)前炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎作用，表明TGP的治療作用可能通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)通路途徑。因此，為了進(jìn)一步探討TGP對(duì)KC作用的機(jī)制，我們

10、選擇Tp38MAPK信號(hào)途徑來(lái)研究TGP作用的可能機(jī)制。
　　 目前，TGP對(duì)KC的具體作用還不明確，因此本研究擬在體外培養(yǎng)的人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞中，以主要由KC分泌的VEGF和IL-23為檢測(cè)指標(biāo)，觀察TGP對(duì)體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、VEGF和IL-23表達(dá)和分泌的影響，及其信號(hào)通路的調(diào)控，探討TGP治療銀屑病的可能機(jī)制。
　　 目的：
　　 1.觀察TGP對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響；

11、>　　 2.觀察TGP對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)VEGF和IL-23的影響；
　　 3.探討P38MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)途徑在TGP對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)VEGF和IL-23調(diào)控中的作用。
　　 方法：
　　 1.HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng)
　　 永生化的角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞用含10％FBS的1640置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
　　 (1)根據(jù)參考文獻(xiàn)選擇不同濃度

12、的TGP加入HaCaT細(xì)胞，測(cè)定HaCaT細(xì)胞增殖的改變；
　　 (2)不同濃度TGP孵育HaCaT細(xì)胞48h后，測(cè)定VEGF和IL-23 mRNA及蛋白的表達(dá)；
　　 (3)HaCaT細(xì)胞經(jīng)p38 MAPK阻斷劑SB203580預(yù)處理2 h后，給予125mg/LTGP孵育，測(cè)定HaCaT細(xì)胞VEGF和IL-23 mRNA及蛋白的表達(dá)；
　　 (4)125mg/LTGP孵育HaCaT細(xì)胞0、5、15、30 min

13、，檢測(cè)p38 MAPK磷酸化的改變；
　　 (5)HaCaT細(xì)胞經(jīng)p38 MAPK阻斷劑SB203580預(yù)處理2 h后，給予TGP孵育，測(cè)定p38 MAPK磷酸化改變。
　　 3.實(shí)驗(yàn)方法
　　 3.1.甲基噻唑基四唑(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法測(cè)定HaCaT細(xì)胞增殖
　　 將HaCaT細(xì)胞分組給予不同濃度TGP干預(yù)，加入5g/L的MTT液20μ l繼續(xù)培養(yǎng)4h，

14、再加入二甲基亞砜150μ l，使結(jié)晶物充分溶解，在酶標(biāo)儀490nm處測(cè)量各孔吸光值。
　　 3.2.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-Time RT-PCR)檢測(cè)VEGF和IL-23 mRNA的表達(dá)
　　 將所收集的細(xì)胞提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，以管家基因GAPDH作為參照，通過(guò)real-time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)VEGF和IL-23 mRNA的表達(dá)。
　　 3.3.雙抗體夾心ELISA法檢

15、測(cè)VEGF和IL-23蛋白表達(dá)
　　 將所收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行孵育、酶反應(yīng)、顯色等步驟，酶標(biāo)儀450nm處測(cè)量各孔吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)濃度。
　　 3.4.Western blot檢測(cè)p38 MAPK蛋白表達(dá)
　　 將所收集的細(xì)胞提取總蛋白，經(jīng)過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印跡、顯色、凝膠成像分析系統(tǒng)成像、應(yīng)用Qwin圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，檢測(cè)p38 MAPK蛋

16、白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.TGP對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響
　　 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，統(tǒng)計(jì)分析顯示：TGP在低濃度0.5mg/L、2.5 mg/L時(shí)對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用(P<0.01)；濃度增高為12.5 mg/L～125 mg/L時(shí)反而對(duì)細(xì)胞的增殖有抑制作用(P<0.01)，且隨TGP濃度的增加抑制作用愈明顯，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TGP125mg/L時(shí)抑制作用最明顯。

17、
　　 2.TGP對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)和分泌VEGF的影響
　　 (1)0.5 mg/LTGP、2.5 mg/LTGP作用于HaCaT細(xì)胞48h，VEGF的分泌量和VEGFmRNA的表達(dá)量均高于對(duì)照組(P<0.05)。12.5 mg/LTGP、62.5mg/LTGP、125 mg/LTGP作用于HaCaT細(xì)胞48h，隨藥物濃度的增加，VEGF的分泌量和VEGFmRNA的表達(dá)量均低于對(duì)照組(P<0.05)。其中TGP濃度為

18、125 mg/L時(shí)VEGF分泌量和VEGFmRNA的表達(dá)量最低。
　　 (2)p38 MAPK阻斷劑.SB203580對(duì).TGP誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)和VEGF蛋白分泌的影響
　　 p38MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理2 h后再給予125 mg/LTGP作用48h，HaCaT細(xì)胞分泌VEGF的量和VEGFmRNA的表達(dá)量均較單獨(dú)125 mg/LTGP作用時(shí)明顯增高(P<0.01)。
　　

19、3.TGP對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)和分泌IL-23的影響
　　 (1)0.5mg/LTGP、2.5mg/LTGP作用于HaCaT細(xì)胞48h，IL-23的分泌量和IL-23mRNA的表達(dá)量均高于對(duì)照組(P<0.05)。62.5mg/LTGP、125mg/LTGP作用于HaCaT細(xì)胞48h，隨藥物濃度的增加，IL-23的分泌量和IL-23mRNA的表達(dá)量均低于對(duì)照組(P<0.05)。其中TGP濃度為125mg/L時(shí)IL-23分泌量和IL

20、-23mRNA的表達(dá)量最低。TGP濃度為12.5mg/L時(shí)IL-23分泌量和IL-23mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 (2)p38 MAPK阻斷劑SB203580對(duì)TGP誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞IL-23mRNA的表達(dá)和IL-23蛋白分泌的影響
　　 p38MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理2 h后再給予125mg/LTGP作用48h，HaCaT細(xì)胞分泌IL-23的量和IL-23mRNA

21、的表達(dá)量均較單獨(dú)125mg/LTGP作用時(shí)明顯增高(P<0.01)。
　　 4.TGP對(duì)HaCaT細(xì)胞p38磷酸化的影響
　　 4.1 TGP對(duì)HaCaT細(xì)胞p38 MAPK磷酸化的影響
　　 125mg/LTGP作用于孵育的HaCaT細(xì)胞，在不同時(shí)間段(5min、10min、30min)收集細(xì)胞，p-p38蛋白表達(dá)于5min達(dá)到高峰，10min后p-p38表達(dá)水平逐漸減弱，但與對(duì)照組表達(dá)水平比較差別仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

22、義(P<0.01)；T-p38蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 4.2 p38 MAPK阻斷劑SB203580對(duì)TGP誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞p38 MAPK磷酸化的影響
　　 HaCaT細(xì)胞經(jīng)p38MAPK阻斷劑SB203580(10μ M)預(yù)處理2 h后，再給予125mg/LTGP孵育5min，結(jié)果經(jīng)SB203580預(yù)處理組p-p38表達(dá)水平明顯低于單獨(dú)TGP給藥組，兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0