過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體δ激動(dòng)劑GW0742對(duì)同型半胱氨酸誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞p47phox的影響及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　動(dòng)脈硬化是是臨床上的常見(jiàn)病與多發(fā)病，是一種會(huì)造成人們患上冠心病、腦血管病等，從而嚴(yán)重危害身體健康和生命的疾病。同型半胱氨酸可以通過(guò)不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活NADPH氧化酶，產(chǎn)生大量的ROS，導(dǎo)致一系列的病理和生理改變，是動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生的一個(gè)重要因素。PPARδ的激活，可能通過(guò)其抗氧化和抗炎的作用減少ROS的產(chǎn)生，防止血管內(nèi)皮組織功能紊亂的發(fā)生，從而限制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，將來(lái)它可能會(huì)成為預(yù)防和治療動(dòng)脈硬化的新靶點(diǎn)。在

2、本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用HCY干預(yù)EA.hy926細(xì)胞誘導(dǎo)氧化應(yīng)激發(fā)生，并應(yīng)用GW0742干預(yù)細(xì)胞作為對(duì)照，觀察p47phoxmRNA，P-p38MAPK、P-p47phox和PPARδ蛋白水平的改變，探討PPARδ抑制氧化應(yīng)激的機(jī)制。
　　方法：
　　1.EA.hy926細(xì)胞傳代培養(yǎng)。
　　2.細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)24h后，使用同型半胱氨酸（50μM）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激30min。提取總RNA，RT-PCR法測(cè)定p47phox mR

3、NA的表達(dá)量。
　　3.細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)24h后，使用同型半胱氨酸（50μM）在不同的時(shí)間（0-40min）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激。提取總蛋白，Western blot測(cè)定p47phox的磷酸化水平。
　　4.細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)24h后，A組實(shí)驗(yàn)使用同型半胱氨酸（50μM）在不同的時(shí)間（0-60min）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激；B組實(shí)驗(yàn)使用GW0742（1μM）預(yù)處理細(xì)胞30min，再使用同型半胱氨酸（50μM）對(duì)細(xì)胞刺30min。用氧化還原敏感的

4、熒光染料DCFH-DA干預(yù)細(xì)胞，然后用熒光顯微鏡測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。
　　5.細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)24h后，使用同型半胱氨酸（50μM）在不同的時(shí)間（0-40min）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激。提取總蛋白，Western blot測(cè)定PPARδ的蛋白水平。
　　6.細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)24h后，使用或不使用GW0742（1μM）或GSK(1μM)預(yù)處理細(xì)胞30min，再使用或不使用HCY（50μM）刺激細(xì)胞30min。提取總蛋白，Western

5、 blot測(cè)定PPARδ的蛋白水平。
　　7.細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)24h后，細(xì)胞使用GW0742(1μM)預(yù)處理，然后使用HCY(50μM)刺激30min，或單獨(dú)使用兩種藥物干預(yù)30min。提取總蛋白，Western blot測(cè)定p38MAPK的磷酸化水平。
　　8.細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)24h后，細(xì)胞使用GW0742(1μM)或SB203580(20μM)預(yù)處理細(xì)胞30min，然后使用HCY(50μM)刺激細(xì)胞30min。提取總蛋白，W

6、estern blot測(cè)定p47phox的磷酸化水平。
　　結(jié)果：
　　1.EA.hy926是人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞系,具有與原始內(nèi)皮細(xì)胞相同的形態(tài)學(xué)分布生物學(xué)活性。
　　2.同型半胱氨酸可以明顯增加p47phox mRNA在EA.hy926的表達(dá)。
　　3.同型半胱氨酸呈時(shí)間依賴(lài)性增加p47phox的磷酸化，各組分別是空白對(duì)照組的1.25、1.45、1.55、1.2倍，當(dāng)刺激時(shí)間為30min時(shí)達(dá)最高峰。

7、　　4.同型半胱氨酸呈時(shí)間依賴(lài)性地增加活性氧的產(chǎn)生，各組分別是空白對(duì)照組的1.1、1.5、2.1、1.8倍，當(dāng)HCY刺激時(shí)間為30min時(shí)，活性氧的產(chǎn)生達(dá)到最高峰；PPARδ激活明顯抑制活性氧的產(chǎn)生。
　　5.同型半胱氨酸呈時(shí)間依賴(lài)性增加PPARδ的表達(dá)，各組分別是空白對(duì)照組的1.06、1.1、1.25、1.02倍，當(dāng)刺激時(shí)間為30min時(shí)達(dá)最高峰。
　　6.單獨(dú)使用同型半胱氨酸和GW0742不同程度地增加PPARδ表達(dá)，而

8、在同型半胱氨酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中，GW0742能顯著地增加PPARδ的表達(dá)，各組分別是空白對(duì)照組的1.25、1.6、2、1.3、1.1倍。
　　7.GW0742能夠抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)的p38MAPK的磷酸化，各組分別是空白對(duì)照組的2、1.5、1.05倍。
　　8.同型半胱氨酸通過(guò)p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路增加p47phox的磷酸化；GW0742能減少p47phox的磷酸化，各組分別是空白對(duì)照組的1.4、1.1、0.9倍。