Period2調(diào)節(jié)小鼠心肌梗死后血管新生的作用及機制研究.pdf

1、本文從以下幾方面進行闡述：
　　第一部分
　　目的：
　　1.觀察野生型小鼠和per2基因敲除(knock out，KO)小鼠外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量的變化;
　　2.觀察per2基因敲除前后小鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能改變;
　　3.探討per2基因影響內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和功能的可能機制。
　　方法：
　　1.對小鼠基因型鑒定并進行合理分組。
　　2.內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　無菌

2、狀態(tài)下分離小鼠股骨和脛骨，獲得單個核細(xì)胞，采用EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，將得到的內(nèi)皮祖細(xì)胞進行流式鑒定及觀察細(xì)胞對乙酰化低密度脂蛋白的攝取和對荊豆凝集素(UEA-I)的綁定進行細(xì)胞鑒定。
　　3.進行實時熒光定量PCR檢測、免疫熒光化學(xué)檢測、內(nèi)皮祖細(xì)胞功能檢測、蛋白免疫印跡試驗檢測、免疫共沉淀檢測等
　　3.心肌內(nèi)注射內(nèi)皮祖細(xì)胞的標(biāo)記
　　采用DiI-C18依據(jù)說明書進行內(nèi)皮祖細(xì)胞的標(biāo)記以備心肌內(nèi)注射用。
　　4

3、.小鼠心梗模型建立
　　使用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，建立呼吸支持，進行冠狀動脈左前降支結(jié)扎術(shù)。頸部及左前胸脫毛備皮，剪開頸部皮膚，行氣管插管。建立有效呼吸支持后，開胸，剪開心包，暴露左冠狀動脈前降支。用6-0或7-0的無損縫合線進行冠狀動脈結(jié)扎，結(jié)扎成功后，左心室前壁顏色變白并且室壁運動異常，顯示造模成功，然后逐層關(guān)胸。
　　5.超聲學(xué)檢測
　　術(shù)前及術(shù)后28天，將異氟烷麻醉的小鼠進行經(jīng)胸超聲心動圖檢測評估左心室功能。選取

4、頻率為35MHz的712型超聲探頭進行的心臟大小和功能參數(shù)的采集，用高分辨率超聲Vevo770系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。探頭放置于小鼠左前胸，在心臟乳頭肌水平進行M型超聲檢測，測量舒張末期左心室內(nèi)徑(LVIDd)、收縮末期左室內(nèi)徑(LVIDs)。系統(tǒng)自動計算射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率。
　　6.組織學(xué)檢測
　　術(shù)后28天處死相應(yīng)小鼠，使用小鼠左心室冰凍和石蠟切片進行組織學(xué)分析。冰凍切片觀察DiI的表達。制備5μm石蠟切片行Masson三色

5、染色及免疫組化染色。用Masson染色進行梗死面積測量，使用免疫組化染色法檢測相關(guān)指標(biāo)的陽性率。
　　7.凋亡檢測
　　使用原位末端凋亡檢測試劑盒檢測梗死周邊區(qū)細(xì)胞的凋亡率，細(xì)胞核完全被染色的細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。
　　8.統(tǒng)計分析
　　所有統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)均使用SPSS16.0軟件分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計分析兩組比較采用t檢驗、多組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)方法，先檢驗方差齊性

6、，若方差齊，使用LSD檢驗;若方差不齊，使用Dunnett'sT3檢驗。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠基因型鑒定結(jié)果
　　野生型小鼠瓊脂糖凝膠電泳后顯像示只有800bp的條帶，per2-/-小鼠顯像示只有400bp條帶，雜合子顯像有400bp和800bp兩個條帶。
　　2.野生型小鼠和per2-/-小鼠外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量存在顯著性差異
　　野生型小鼠外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞在6點處于

7、較低水平，12點時升至較高水平，隨之下降，18點時較12點有明顯下降，但高于6點水平。呈現(xiàn)出節(jié)律性變化。而per2-/-小鼠外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量的節(jié)律性變化消失，在12點和18點時內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量明顯低于野生型小鼠在這兩個時間點的數(shù)量。
　　3.內(nèi)皮祖細(xì)胞被成功分離并培養(yǎng)
　　骨髓來源的單個核細(xì)胞在采用EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)4天即可見集落樣細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶。7天后，這些細(xì)胞能夠攝取DiI-AcLDL以及荊豆凝集素，大量細(xì)胞表面表

8、達CD34、VEGFR2，少量表達CD45表面標(biāo)記物。
　　4.Per2 mRNA表達
　　野生型小鼠骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞表達per2的mRNA，而per2-/-小鼠骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞不表達。
　　5.Per2蛋白表達
　　免疫熒光試驗檢測到野生型小鼠骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞有per2蛋白表達。
　　6.兩種內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能檢測結(jié)果
　　Per2-/-小鼠骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖功能、遷移功能、以及成

9、管、粘附功能較野生小鼠明顯下降。LY294002（PI3K信號通路抑制劑）能夠抑制野生型內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖功能。采用胰島素樣生長因子-1(insulin like growth factor，IGF-1)刺激per2-/-內(nèi)皮祖細(xì)胞其增殖功能得以恢復(fù)，但遷移、成管、粘附功能未恢復(fù)。
　　7.PI3K/Akt/Foxo3a及CXCR4蛋白表達結(jié)果
　　Per2-/-的內(nèi)皮祖細(xì)胞PI3K/Akt/Foxo3a蛋白表達明顯受到抑制，

10、CXCR4表達量明顯下降，采用IGF-1刺激后PI3K/Akt/Foxo3a的磷酸化表達量有所上調(diào)，但CXCR4的表達未發(fā)生改變。
　　8.Per2蛋白和CXCR4之間相互作用的檢測結(jié)果
　　Per2和CXCR4蛋白間存在直接相互作用。
　　9.心梗后4周心臟上DiI表達的結(jié)果
　　野生型內(nèi)皮祖細(xì)胞治療組心臟上DiI的數(shù)量明顯高于Per2-/-內(nèi)皮祖細(xì)胞治療組，且野生型內(nèi)皮祖細(xì)胞治療組能明顯觀察到標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞

11、在血管上的表達。
　　10.小鼠心梗模型的建立結(jié)果
　　成功構(gòu)建小鼠心梗模型。
　　11.超聲學(xué)檢測結(jié)果
　　Per2-/-內(nèi)皮祖細(xì)胞治療組心功能明顯低于野生型內(nèi)皮祖細(xì)胞治療組。
　　12.心梗面積及免疫組化檢測結(jié)果
　　Per2-/-內(nèi)皮祖細(xì)胞治療組心臟梗死面積明顯大于野生型內(nèi)皮祖細(xì)胞治療組。并且Per2-/-內(nèi)皮祖細(xì)胞治療組心臟上的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯多于野生型內(nèi)皮祖細(xì)胞治療組。Per2-/-內(nèi)皮祖細(xì)

12、胞治療組心臟上的血管新生及動脈新生數(shù)量明顯少于野生型內(nèi)皮祖細(xì)胞治療組。
　　結(jié)論：
　　1.per2基因能夠調(diào)節(jié)小鼠外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量的節(jié)律性變化。
　　2.per2基因能夠影響內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移、成管、粘附功能。
　　3.per2基因通過PI3K/Akt/FoxO3信號通路及CXCR4影響內(nèi)皮祖細(xì)胞的上述功能。
　　4.per2基因能夠影響內(nèi)皮祖細(xì)胞心梗后的血管新生。
　　第二部分
　　

13、目的：
　　1.體內(nèi)實驗觀察Per2對心肌梗死后外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的動員情況;
　　2.體內(nèi)實驗觀察Per2調(diào)節(jié)血管新生在缺血心臟中的表達情況;
　　3.體外實驗觀察Per2對骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下的遷移、成管功能的影Ⅱ向;
　　4.探索Per2增強缺氧狀態(tài)下骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移、成管功能的機制。
　　方法：
　　動物分組及心梗模型建立，進行超聲檢測、外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量的動員檢測、骨髓微環(huán)

14、境檢測、組織病理學(xué)檢測、細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定，并在細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下的功能學(xué)檢測和蛋白免疫印跡實驗檢測。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用SPSS16.0軟件做統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠模型建立情況
　　成功構(gòu)建小鼠心肌梗死模型。
　　2.超聲學(xué)對心功能檢測的結(jié)果
　　心梗后28天，per2-/-小鼠心功能明顯低于野生型小鼠心功能。
　　3.外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞心梗后動員情況
　　心梗后3天，兩組小鼠相對

15、于對照組外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量均有明顯上升，但per2-/-小鼠外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞動員的比例明顯低于野生型小鼠。
　　4.骨髓微環(huán)境檢測結(jié)果
　　心梗后3天，野生型小鼠相對于對照組骨髓Akt及ERK出現(xiàn)明顯磷酸化，但per2-/-小鼠骨髓上述信號通路的磷酸化不明顯。
　　5.心梗面積及心臟上內(nèi)皮祖細(xì)胞及血管新生檢測結(jié)果
　　心梗后28天，per2-/-小鼠心梗面積明顯大于野生型小鼠，心臟上內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量及新生血管數(shù)

16、量卻明顯少于野生型小鼠。
　　6.內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果
　　于培養(yǎng)7天后成功獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞，這些細(xì)胞能夠攝取乙?；兔芏戎鞍准扒G豆凝集索。同時大多數(shù)細(xì)胞外膜能夠表達CD34、CD31及VEGFR2。
　　7.細(xì)胞缺氧狀態(tài)下功能檢測結(jié)果
　　缺氧狀態(tài)下，Per2-/-抑制了缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能激活，使得敲除基因后的內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移及成管功能明顯低于野生型小鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞。
　　8.蛋白免疫印跡實

17、驗相關(guān)機制的檢測結(jié)果
　　缺氧能夠增加野生型小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞的Per2蛋白表達，并能激活PI3K/Akt信號通路，但Per2-/-抑制了該信號通路的激活，從而可能通過該信號通路抑制了缺氧狀態(tài)下的內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能。
　　結(jié)論：
　　1.Per2基因能夠調(diào)節(jié)小鼠心梗后的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的動員;
　　2.Per2基因通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞的動員及缺氧狀態(tài)下的功能進而影響心肌梗死后心臟上的血管新生;
　　3.Per2基因可