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文檔簡介
1、第一部分、調(diào)節(jié)性T細胞過繼轉(zhuǎn)輸減輕心肌梗死后心室重塑并改善心功能
目的:急性心肌梗死后(AMI)持續(xù)激活的炎癥反應(yīng)參與心肌梗死后心室重塑的發(fā)生發(fā)展,然而抑制炎癥反應(yīng)的內(nèi)源性保護機制尚未明確。CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)是一群具有抑制炎癥反應(yīng)的T細胞亞群。本實驗的目的觀察Treg對MI后心室重塑和心功能的影響。
方法:結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型,假手術(shù)的大鼠(Sha
2、m)僅予以穿針帶線而不結(jié)扎。免疫組化的方法檢測不同時間點(第3天,第7天和第14天)梗死心臟中Treg的浸潤。免疫磁珠分選純化的Lewis 大鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細胞和非調(diào)節(jié)性CD4+T細胞。將MI 大鼠隨機過繼轉(zhuǎn)輸5×106 調(diào)節(jié)性T細胞(MITreg)或非調(diào)節(jié)性CD4+T細胞(MITconv),部分MI 大鼠僅予以相同量的PBS 作為陰性對照(MI)。
細胞過繼后24 小時觀察過繼轉(zhuǎn)輸T細胞在梗死大鼠心臟局部和淋巴結(jié)的分布。
3、免疫組化的方法觀察細胞過繼后第3天梗死心臟中Treg的浸潤。第28天用超聲和血流動力學(xué)評估模型大鼠的心室擴張和心功能,指標(biāo)包括心率(HR),左室收縮末內(nèi)徑(LVESD),左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD),分數(shù)縮短率(FS),左室收縮壓(LVSP),左室舒張末壓(LVEDP),左室壓力最大上升速率(+dp/dtmax)和最小下降速率(-dp/dtmin),Masson 染色法評估梗死區(qū)(IZ)的梗死面積及梗死周邊區(qū)(PIZ)和非梗死區(qū) (NI
4、Z)的纖維化,明膠酶譜法評估NIZ的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2的活性,TUNEL 法評估PIZ和NIZ的心肌細胞凋亡。
結(jié)果:心肌梗死后的第3天,7天和14天在梗死心臟中均可見Treg,浸潤的細胞集中于PIZ 且數(shù)目在第7天達高峰。過繼轉(zhuǎn)輸后,Treg 能夠趨化至MI后梗死心臟和淋巴結(jié)并導(dǎo)致PIZ的Treg 數(shù)目上調(diào)。與Sham組大鼠比較,MI組大鼠左心室擴張且心功能減低,LVEDD,LVESD和LVEDP 均升高,LV
5、SP,F(xiàn)S,+dp/dtmax和-dp/dtmin 均降低。
與MI組大鼠比較,MITreg組大鼠的心室擴張和心功能顯著改善,LVEDD,LVESD和LVEDP均降低,F(xiàn)S,+dp/dtmax和-dp/dtmin 均升高;梗死面積無明顯改變,PIZ和NIZ的纖維化,NIZ的MMP-2的活性,PIZ和NIZ的心肌細胞凋亡則顯著降低。MITconv大鼠與MI組大鼠相比較心功能和心室重塑無明顯差異。
結(jié)論:過繼轉(zhuǎn)輸
6、Treg 上調(diào)心肌梗死局部的Treg 浸潤數(shù)目,減輕MI后心室重塑并改善心功能。Treg 可能作為一種內(nèi)源性保護機制參與MI后心室重塑的發(fā)生發(fā)展。
第二部分、調(diào)節(jié)性T細胞抑制心肌梗死誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)
目的:研究Treg 對MI 誘導(dǎo)的心臟局部炎癥反應(yīng)和系統(tǒng)細胞毒性反應(yīng)的影響,探討其減輕心室重塑,改善心功能的作用機制。
方法:免疫磁珠分選純化的Lewis 大鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細胞和非調(diào)節(jié)性CD4+T細胞
7、。通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型,假手術(shù)的大鼠僅予以穿針帶線而不結(jié)扎。將MI 大鼠隨機過繼轉(zhuǎn)輸5×106 調(diào)節(jié)性T細胞(MITreg)或非調(diào)節(jié)性CD4+T細胞(MITconv),部分MI 大鼠僅予以相同量的PBS 作為陰性對照(MI)。免疫組化的方法檢測不同時間點(第3天,第7天和第14天)心臟死周邊區(qū)(PIZ)的炎癥細胞包括中性粒細胞(MPO+),巨噬細胞(CD68+)和 T 淋巴細胞(CD3+)的浸潤。
8、 RT-PCR的方法比較第7天PIZ 炎癥細胞因子包括腫瘤壞死因子(TNF)-α,白介素(IL)-1β,轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1和IL-10的表達。結(jié)晶紫法比較第14天脾臟淋巴細胞對心肌細胞的殺傷能力。流式細胞術(shù)評估第14天脾臟CD8+細胞毒性T細胞的增殖。
結(jié)果:心肌梗死后在PIZ 區(qū)可觀察到明顯的中性粒細胞,巨噬細胞和T 淋巴細胞的浸潤。中性粒細胞的數(shù)目在第3天達高峰,在第7天和14天恢復(fù)至基線水平。巨噬細胞的
9、數(shù)目亦在第3天達高峰,在第7天和第14天逐漸降低。T 淋巴細胞的數(shù)目在第7天達高峰后逐漸降低。與MI組大鼠比較,MITreg組大鼠心肌梗死局部的中性粒細胞,巨噬細胞和T 淋巴細胞的數(shù)目均降低。與Sham組大鼠比較,MI組大鼠心臟PIZ的促炎因子TNF-α和IL-1β,抗炎因子TGF-β1和IL-10的表達均上調(diào),脾臟淋巴細胞對培養(yǎng)的乳鼠心肌的殺傷能力增加,CD8+細胞毒性T細胞增殖率升高。與MI組大鼠比較,MITreg組大鼠心臟中促炎因
10、子TNF-α和IL-1β的表達減低,抗炎因子IL-10的表達升高,TGF-β1的表達則無明顯改變;脾臟淋巴細胞對培養(yǎng)的乳鼠心肌的殺傷能力下降,CD8+細胞毒性T細胞增殖率降低。MITconv 大鼠與MI組大鼠相比較心肌局部炎癥反應(yīng)和系統(tǒng)細胞毒性反應(yīng)無明顯差異。
結(jié)論:Treg細胞抑制心肌梗死誘導(dǎo)的心臟局部炎癥反應(yīng)和系統(tǒng)細胞毒性反應(yīng),從而減輕心室重塑,改善心功能。
第三部分、調(diào)節(jié)性T細胞抑制心肌細胞凋亡的作用機
11、制研究
目的:研究Treg 對心肌細胞凋亡的影響和機制,探討其減輕心室重塑,改善心功能的作用機制。
方法:單獨培養(yǎng)的乳鼠心室肌細胞,或與免疫磁珠法純化的Tconv或Treg以10:1比例共培養(yǎng)的乳鼠心室肌細胞,經(jīng)CD3 單抗刺激48 小時再予以LPS 刺激24 小時后,TUNEL 法評估心肌細胞的凋亡,ELISA 法檢測細胞上清中細胞因子TNF-α,IL-1β,TGF-β1和IL-10的濃度。
12、結(jié)果:心肌細胞單獨培養(yǎng)時,與未加LPS的對照組相比 (5.2±1.2%),經(jīng)LPS 刺激后的心肌細胞凋亡率明顯升高(18.1±1.2%,p<0.01)。與Treg 共培養(yǎng)的心肌細胞經(jīng)LPS 刺激后的凋亡率(9.2±1.0%,p<0.01)明顯低于單獨培養(yǎng)時或與Tconv 共培養(yǎng)(18.7±2.5%)。含有Treg的共培養(yǎng)體系細胞上清中的細胞因子TGF-β1和IL-10的濃度明顯高于心肌單獨培養(yǎng)時或與含有Tconv的共培養(yǎng)體系。在Treg
13、與心肌細胞共培養(yǎng)體系中加入單克隆抗體阻斷IL-10的效應(yīng)或者用半透膜阻斷心肌細胞和Treg的直接接觸后,心肌細胞凋亡率升高,但仍低于心肌細胞單獨培養(yǎng)體系中的凋亡率。加入單克隆抗體阻斷TGF-β1后則不影響Treg與心肌細胞共培養(yǎng)體系中心肌細胞凋亡。與心肌細胞單獨培養(yǎng)體系比較,加入Treg 明顯降低心肌細胞TNF-α和IL-1β的分泌。
結(jié)論:Treg 通過細胞直接接觸和分泌細胞因子IL-10 減輕心肌細胞凋亡,并抑制心肌細
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