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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
通過(guò)lncRNA芯片分析重癥肌無(wú)力并發(fā)胸腺瘤患者組和重癥肌無(wú)力胸腺無(wú)異常組及健康對(duì)照組的差異lncRNAs和mRNA表達(dá);運(yùn)用生物信息學(xué)方法,預(yù)測(cè)并分析差異lncRNA的共表達(dá)靶基因、lncRNA的生物學(xué)功能聚類(lèi)以及參與的信號(hào)通路,通過(guò)cis和trans預(yù)測(cè)分析差異lncRNA參與基因調(diào)控中作用機(jī)制,構(gòu)建TF-lncRNA-靶基因三者的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系;采用real-time PCR技術(shù),驗(yàn)證代表性具有差異表達(dá)的lncRNAs
2、;為探討lncRNAs在重癥肌無(wú)力患者發(fā)病機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。
方法:
1.收集重癥肌無(wú)力患者及健康正常對(duì)照組患者外周血標(biāo)本,分離外周血淋巴細(xì)胞并提取總RNA。
2.通過(guò)lncRNA芯片,檢測(cè)和分析重癥肌無(wú)力患者外周血的lncRNA與mRNA表達(dá)譜,以差異倍數(shù)大于或等于2,且p小于等于0.05為標(biāo)準(zhǔn),篩選出重癥肌無(wú)力并發(fā)胸腺瘤患者組與健康對(duì)照組比較存在的差異表達(dá)lncRNA和mRNA分子。
3.
3、通過(guò)生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)靶基因、分析基因聚類(lèi)、預(yù)測(cè)富集生物學(xué)通路以及構(gòu)建TF-lncRNA-靶基因網(wǎng)絡(luò)關(guān)系:利用pearson相關(guān)系數(shù)預(yù)測(cè)差異表達(dá)的lncRNA的靶基因;針對(duì)差異性表達(dá)的lncRNA的靶基因,應(yīng)用ENCODE數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)可能富集的生物學(xué)信號(hào)通路,進(jìn)行基因聚類(lèi)(GO與pathway)分析,關(guān)聯(lián)分析構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò);采用Cytoscape構(gòu)建TF-lncRNA-靶基因三元網(wǎng)絡(luò)關(guān)系
4.實(shí)時(shí)熒光PC
4、R驗(yàn)證具有代表性差異表達(dá)lncRNAs:選取lncRNA芯片檢測(cè)具有代表性顯著差異表達(dá)的lncRNAs,采用real-time PCR技術(shù),驗(yàn)證其在重癥肌無(wú)力并發(fā)胸腺瘤組和無(wú)胸腺異常組及健康對(duì)照組中的差異表達(dá)。
結(jié)果:
1.lncRNA芯片分析顯示,重癥肌無(wú)力胸腺瘤患者組和健康對(duì)照比較存在1489個(gè)顯著差異lncRNA分子,其中218個(gè)上調(diào),1271個(gè)下調(diào);有862個(gè)差異的mRNA分子,其中上調(diào)的mRNA有249個(gè),
5、下調(diào)的mRNA有613個(gè)。重癥肌無(wú)力胸腺無(wú)異?;颊呓M和健康對(duì)照比較存在342個(gè)顯著差異lncRNA分子,其中172個(gè)上調(diào),170個(gè)下調(diào);存在353個(gè)差異的mRNA分子,其中上調(diào)的mRNA有263個(gè),下調(diào)的mRNA有90個(gè)。重癥肌無(wú)力并發(fā)胸腺瘤組和重癥肌無(wú)力胸腺無(wú)異常組比較存在281個(gè)差異顯著lncRNA分子,其中52個(gè)上調(diào),229個(gè)下調(diào)。存在204個(gè)差異的mRNA分子,其中上調(diào)的mRNA有59個(gè),下調(diào)的mRNA有145個(gè)。
2
6、.在重癥肌無(wú)力并發(fā)胸腺瘤與健康對(duì)照組,首先選取差異顯著性上調(diào)lncRNA oebiotech_11933、 lncRNA A_24_ P927716和下調(diào)顯著性lncRNAA_21_P0010030、lncRNA A_21_P0002844逐一分析其共表達(dá)靶基因、GO和pathway,并采用real-time PCR驗(yàn)證其表達(dá),整體差異lncRNA的GO功能和pathway分析結(jié)果顯示,細(xì)胞對(duì)干擾素γ的響應(yīng)在重癥肌無(wú)力并發(fā)胸腺瘤發(fā)病機(jī)制
7、中發(fā)揮重要的作用,其次依次為正向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子產(chǎn)生、調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子受體結(jié)合等生物學(xué)功能。通過(guò)cis確定了17個(gè)lncRNA在染色體上的調(diào)控關(guān)系;同時(shí)通過(guò)trans作用機(jī)制分析,構(gòu)建了CTCF、TAF1等轉(zhuǎn)錄因子與差異lncRNA的二元組關(guān)系及其網(wǎng)絡(luò),與mRNA的共表達(dá)關(guān)系構(gòu)建 CTCF—lncRNAoebiotech_24272—SOST等三元互相調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
3.在重癥肌無(wú)力胸腺無(wú)異常組與健康對(duì)照組中,選取差異顯著
8、性上調(diào)lncRNA oebiotech_11933、lncRNA oebiotech_03926和下調(diào)顯著性lncRNA oebiotech_02627、lncRNA oebiotech_22482逐一分析其共表達(dá)靶基因、GO和pathway,采用real-time PCR驗(yàn)證其表達(dá),整體差異lncRNA的GO功和pathway分析結(jié)果顯示,血小板脫粒化和細(xì)胞對(duì)干擾素的響應(yīng)在其中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能,其次依次為調(diào)節(jié)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)、負(fù)向調(diào)節(jié)
9、離子運(yùn)輸、炎癥反應(yīng)、糖皮質(zhì)激素刺激、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子生成過(guò)程等生物學(xué)功能,通過(guò)cis確定了6個(gè)lncRNA在染色體上的調(diào)控關(guān)系;通過(guò)trans作用機(jī)制分析,構(gòu)建了CTCF、MYC等轉(zhuǎn)錄因子與差異lncRNA的二元組關(guān)系及其網(wǎng)絡(luò),與mRNA的共表達(dá)關(guān)系構(gòu)建CTCF—lncRNAA_21_P0007083—NUS1等三元互相調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
4.在重癥癥肌無(wú)力胸腺瘤組與重癥肌無(wú)力胸腺無(wú)異常組,選取差異顯著性上調(diào)lncRNA oebiotec
10、h_13222、lncRNA A_19_P00315959和下調(diào)顯著性lncRNA oebiotech_22652、lncRNA oebiotech_16223逐一分析其共表達(dá)靶基因,GO和pathway,采用real-time PCR驗(yàn)證其表達(dá)。整體差異lncRNA的GO功能和pathway分析顯示,確定趨化因子受體結(jié)合,細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用信號(hào)通路在其中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能,其次分別是正向調(diào)節(jié)白細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng),細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)
11、、離子的運(yùn)輸?shù)壬飳W(xué)功能。通過(guò)cis確定了6個(gè)lncRNA在染色體上的調(diào)控關(guān)系;通過(guò)trans作用機(jī)制分析,構(gòu)建了CTCF—lncRNA oebiotech_22642—SMCR7L等三元互相調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
5.整體差異lncRNA的GO功能和pathway分析結(jié)果顯示,與健康對(duì)照組比較,無(wú)論MG是否合并胸腺瘤,細(xì)胞對(duì)干擾素γ的響應(yīng)均在發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用;而MG合并胸腺瘤組與胸腺無(wú)異常組比較,趨化因子受體結(jié)合,細(xì)胞因子與細(xì)胞
12、因子受體相互作用信號(hào)通路在其中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能,其次分別是正向調(diào)節(jié)白細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng),細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子的運(yùn)輸?shù)壬飳W(xué)功能。
結(jié)論:
1.通過(guò)lncRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)了重癥肌無(wú)力并發(fā)胸腺瘤患者組和重癥肌無(wú)力胸腺無(wú)異常組及健康對(duì)照組的差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs。
2.通過(guò)分析三組部分差異lncRNA的cis和TF調(diào)控關(guān)系,確定了lncRNA在染色體上的調(diào)控關(guān)系。
3.通過(guò)trans作用機(jī)
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