奎尼酸生物合成的代謝工程研究.pdf

1、奎尼酸是一種具有極高價值的精細化工產(chǎn)品和醫(yī)藥中間體，在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、化工等行業(yè)均有較大的用途。本研究是將代謝工程技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)奎尼酸基因工程菌的構(gòu)建。根據(jù)代謝工程原理系統(tǒng)分析了細胞代謝網(wǎng)絡(luò)，并利用DNA重組技術(shù)合理設(shè)計細胞代謝途徑及其遺傳修飾，進而完成細胞特性改造。目的是在大腸桿菌中構(gòu)建奎尼酸生物合成途徑，將碳代謝流最大程度的引向奎尼酸生成的方向。 利用大腸桿菌莽草酸途徑合成新的代謝物奎尼酸，需要提高上游幾種代謝中間產(chǎn)物PE

2、P、E4P、DA/HP、DHQ的含量，與之對應(yīng)的編碼其合成酶的幾種基因分別是ppsA、tktA、aroG、aroB。另外須在宿主細胞引入編碼與奎尼酸合成有關(guān)的異源酶基因擴展代謝途徑，然后串聯(lián)表達酶基因，同時適量增加不同種屬的多個關(guān)鍵酶的有效含量，改善限速反應(yīng)。利用同源重組進行基因整合和基因破壞，改造染色體結(jié)構(gòu)定向改變微生物代謝途徑。本文主要從以下幾個方面對奎尼酸基因工程菌進行了改造： 1．編碼奎尼酸脫氫酶的qutB基因是來自于構(gòu)

3、巢曲霉。在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一系列包含qutB基因的表達重組質(zhì)粒。SD序列與起始密碼子不同距離的pBVqutB1，pBVqutB2；具有qutB雙拷貝三基因串聯(lián)的pBVqutBqutBaroG；具有ppsA、tktA、qutB三基因串聯(lián)的pBvPTB，以及新構(gòu)建的單基因重組質(zhì)粒pETqutB，pBVtacqutB，pTrcqutB。并對含有qutB基因的一系列重組質(zhì)粒在大腸桿菌中進行了表達與否的驗證。結(jié)果顯示pTrcqutB，pBVta

4、cqutB沒有特異的蛋白表達帶，說明pTrc99a和pBvtac載體不適合用于qutB基因的表達。pETqutB經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后有特異的蛋白表達，并且在2-5小時內(nèi)隨著時間的延長而增加，但是時間更長(7h)則因為蛋白降解而出現(xiàn)表達蛋白減少的跡象。pBVqutB1和pBVqutB2同本實驗室保存的pBVqutB沒有出現(xiàn)明顯的蛋白表達量上的差異，這說明利用pBV220表達載體表達qutB基因，起始密碼子與SD序列之間距離的遠近并不是影響其

5、表達量的關(guān)鍵。含有兩個qutB基因和一個aroG基因的多基因串連質(zhì)粒pBVqutBqutBaroG，經(jīng)過熱誘導(dǎo)，也出現(xiàn)了非常明顯的表達條帶。 2．對含有qutB基因在大腸桿菌中可以表達幾種重組質(zhì)粒進行酶活測定，與含有pBVqutB的對照菌相比，含有pBVqutB1，pBVqutB2的菌株的奎尼酸脫氫酶的酶活沒有明顯變化，三基因串聯(lián)的pBVqutBqutBaroG甚至出現(xiàn)了酶活降低的現(xiàn)象。 3．成功地從粗糙脈孢菌的基因組中

6、克隆了奎尼酸脫氫酶的基因qa-3，并與幾種表達載體連接得到了pBVqa3、pETqa3、pBVtacqa3、pTrcqa3，但是這些質(zhì)粒重組子在大腸桿菌中均沒有觀察到該基因的特異表達條帶。 4．結(jié)合qa-3基因的密碼子的特點和計算機模擬的mRNA二級結(jié)構(gòu)，對aq-3基因的密碼子和mRNA二級結(jié)構(gòu)進行改造，優(yōu)化該基因的密碼子結(jié)構(gòu)，降低形成mRNA二級結(jié)構(gòu)的自由能，得到新的基因qa3RG<'m>。構(gòu)建的pBVqa3RG<'m>重組質(zhì)

7、粒在大腸桿菌中成功的表達了奎尼酸脫氫酶，酶活也比對照明顯提高。同時還構(gòu)建了ppsA、tktA、qa3RG<'m>三基因串聯(lián)的重組質(zhì)粒pBVPTA。 5．成功的構(gòu)建了pUC-DK、pUC-DAK、pUC-DBK并制備了線性化片段DK、DAK、DBK，為基因敲除和基因替換做好了準備。利用Red重組系統(tǒng)成功的地進行了基因敲除和基因替換，并穩(wěn)定了敲除和替換菌株的基因型，把這株菌株定名為大腸桿菌31K。 6．成功的構(gòu)建奎尼酸發(fā)酵的

8、工程菌5、AP、B、A、BP、5K、APK、BK、AK、BPK、220K。通過實驗室搖瓶初步發(fā)酵，在硅膠板上可以初步確定，菌株AP(31BK/pBVPqlA)產(chǎn)生的奎尼酸量最大，也最穩(wěn)定。 7．將菌株AP擴大搖瓶發(fā)酵的規(guī)模，然后經(jīng)過樹脂富集，HPLC制備，得到了微量的奎尼酸樣品。經(jīng)過紅外光譜、核磁共振、電子噴霧質(zhì)譜以及紫外、液質(zhì)聯(lián)用等的鑒定可以確定與奎尼酸標準品無差異，由此可以確定我們利用生物合成并且分離鑒定了奎尼酸。