芩丹膠囊及其有效成分槲皮素逆轉(zhuǎn)自發(fā)性高血壓大鼠心室肥厚的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分芩丹膠囊逆轉(zhuǎn)自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚的實(shí)驗(yàn)研究
　　研究背景：
　　高血壓病是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)心血管疾病之一，心室肥厚是高血壓病常見(jiàn)的并發(fā)癥，是心臟猝死和其他心血管事件的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，主要病理表現(xiàn)包括心肌細(xì)胞肥大、心肌間質(zhì)細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)的堆積，探討高血壓心室肥厚的發(fā)生機(jī)制對(duì)防治高血壓靶器官損害、降低死亡率具有重要意義。
　　過(guò)氧化物酶增殖物激活受體γ(peroxisome proliferat

2、er-activated receptor-γ，PPAR-γ)是一類配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，近年來(lái)的研究證實(shí)，在逆轉(zhuǎn)高血壓心室肥厚的過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用，在配體的激動(dòng)下，PPARγ能抑制相關(guān)肥厚基因的表達(dá)，對(duì)高血壓心室肥厚引起的心力衰竭起著預(yù)防和治療的作用。NF-κB的激活在心肌肥厚的發(fā)展過(guò)程中至關(guān)重要，近年來(lái)研究表明NF-κB可能是抑制心肌肥厚的重要作用靶點(diǎn)。PPARγ可以直接與NF-κB發(fā)生蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用，形成

3、轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，同時(shí)降低NF-κB與DNA結(jié)合活性，抑制NF-κBDNA合成，起到抑制其表達(dá)的作用。
　　芩丹膠囊(Qindan Capsule，QC)是導(dǎo)師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制成的治療高血壓病肝熱血瘀證的中藥復(fù)方制劑，前期研究表明其在改善高血壓血管重構(gòu)中起著重要的作用，本研究通過(guò)研究芩丹膠囊對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)心肌組織的病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的影響，應(yīng)用免疫組織化

4、學(xué)法(immunohistochemistry)檢測(cè)PPAR-γ和NF-κB的蛋白表達(dá)的改變，以及熒光實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)對(duì)下游肥厚基因ANP、BNP的mRNA表達(dá)的影響，探討芩丹膠囊對(duì)改善SHR高血壓心室肥厚的作用機(jī)制，為芩丹膠囊治療高血壓心室肥厚的臨床應(yīng)用提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：
　　1.觀察芩丹膠囊對(duì)SHR大鼠心肌形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的改變及對(duì)大鼠血壓的影響，探討芩丹膠囊抑制SHR大鼠心

5、肌肥厚的療效。
　　2.觀察芩丹膠囊在抑制SHR大鼠心肌肥厚對(duì)PPAR-γ和NF-κB的蛋白表達(dá)以及對(duì)下游肥厚基因ANP、BNP的mRNA表達(dá)的影響，探討芩丹膠囊抑制SHR大鼠心肌肥厚的信號(hào)調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1.研究對(duì)象:8周齡雄性SHR大鼠32只和8周齡Wistar-Kyoto大鼠(WKY)8只。隨機(jī)分為5組，每組8只:
　　(1)WKY對(duì)照組;
　　(2)SHR對(duì)照組;
　　(3)SHR

6、+替米沙坦組(SHR+Tel);
　　(4)SHR+芩丹膠囊大劑量組(SHR+QCH);
　　(5)SHR+芩丹膠囊小劑量組(SHR+QCL)。
　　SHR+Tel組給予Tel10mg/(kg·d)，SHR+QCH組給予芩丹膠囊750mg/(kg-d)，SHR+QCL組給予芩丹膠囊150mg/（kg·d），WKY對(duì)照組和SHR對(duì)照組分別給予等量蒸餾水。各組大鼠均分別灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥12周。末次給藥后禁食24

7、h，不禁水。3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射，麻醉后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.研究?jī)?nèi)容:
　　(1)每?jī)芍軠y(cè)量尾動(dòng)脈收縮壓(SBP)，每周稱取體質(zhì)量(BW)一次;
　　(2)處死動(dòng)物后，稱取左心室質(zhì)量(LVM)，并計(jì)算左室相對(duì)質(zhì)量指數(shù)(LVM/BW);
　　(3)HE染色觀察各組大鼠心肌組織形態(tài);
　　(4)電鏡觀察各組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu);
　　(5)免疫組織化學(xué)測(cè)定心肌組織中PPAR-γ和N

8、F-κB蛋白的表達(dá);
　　(6)實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)心肌組織中肥厚基因ANP、BNP的mRNA的表達(dá)。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料統(tǒng)一采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。兩個(gè)組之間的數(shù)據(jù)比較用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組之間的均數(shù)比較用單因素或多因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni post-hoc檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.各組大鼠

9、治療前后收縮壓的動(dòng)態(tài)變化
　　與8周齡WKY陰性對(duì)照組大鼠比較，8周齡SHR陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血壓已經(jīng)明顯升高(P＜0.05)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，陽(yáng)性對(duì)照組SHR大鼠收縮壓呈持續(xù)升高狀態(tài)，與20周齡陰性對(duì)照組的WKY組相比，20周齡陽(yáng)性對(duì)照SHR組大鼠收縮壓顯著增加(P＜0.05)。從給藥第4周起，SHR+QCH組、SHR+QCL組、SHR+Tel組大鼠的血壓與SHR對(duì)照組相比均有下降，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但各組下降程度

10、不同;給藥7周到12周期間，SHR+QCH組較SHR+QCL組血壓下降更為顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。20周齡SHR+Tel組大鼠收縮壓與同周齡SHR+QCH組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.左室相對(duì)質(zhì)量(LVM/BW)
　　與20周齡正常血壓對(duì)照組WKY大鼠相比，20周齡SHR組大鼠與對(duì)照組WKY大鼠相比LVM/BW明顯升高(P＜0.05)。與20周齡SHR組相比，SHR+QCH組，SHR+Q

11、CL組和SHR+Tel組大鼠LVM/BW顯著減小(P＜0.05)。兩兩比較分析，SHR+QCH組與SHR+QCL組差異較顯著(P＜0.05)。
　　3.各組大鼠心肌組織切片光鏡下HE染色觀察
　　20周齡WKY組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核大小均一，胞漿染色分布均勻。SHR組大鼠可見(jiàn)心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核大小不規(guī)則，胞漿染色加深，細(xì)胞內(nèi)心肌纖維斷裂，單位面積內(nèi)細(xì)胞核數(shù)量增多的表現(xiàn)。與SHR組大鼠比較，SHR+Tel組和SH

12、R+QCH組、SHR+QCL組大鼠見(jiàn)心肌細(xì)胞排列較為整齊，細(xì)胞核偶見(jiàn)大小不規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)心肌纖維斷裂情況明顯好轉(zhuǎn)，單位面積細(xì)胞核數(shù)目略增多。
　　4.各組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)的觀察
　　電鏡下，WKY心肌纖維排列清晰、整齊，心肌細(xì)胞質(zhì)膜連續(xù)、完整，線粒體結(jié)構(gòu)、閏盤(pán)結(jié)構(gòu)正常;粗細(xì)肌絲排列整齊，肌小節(jié)及明暗各帶清晰可見(jiàn)，Z線較清晰，間質(zhì)纖維無(wú)增生，細(xì)胞核染色質(zhì)分布較均勻;SHR組大鼠心肌纖維排列稀疏、紊亂，線粒體腫脹、破壞甚至呈空

13、泡狀，Z線增寬模糊，可見(jiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)邊聚的現(xiàn)象;伴有肌原纖維呈灶性溶解，出現(xiàn)肌節(jié)對(duì)位不齊，肌絲扭曲、斷裂，間質(zhì)可見(jiàn)大量膠原纖維分布。SHR+Tel組，SHR+QCH組，SHR+QCL組較SHR組好轉(zhuǎn)，大部分肌纖維排列緊密，線粒體結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，且排列適當(dāng)，細(xì)胞核無(wú)明顯邊聚現(xiàn)象，間質(zhì)內(nèi)膠原堆積已不明顯。
　　5.心肌組織免疫組織化學(xué)PPARγ、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較
　　(1)與20周齡陰性對(duì)照組WKY組相比，陽(yáng)性對(duì)照SHR

14、組大鼠PPARγ蛋白的表達(dá)較WKY組明顯減少(P＜0.05);SHR+Tel組，SHR+QCH組，SHR+QCL組較SHR組PPARγ核表達(dá)明顯增多(P＜0.05)，有顯著性差異;SHR+QCH組與SHR+QCL組差異較顯著(P＜0.05)，但和SHR+Tel組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　(2)與20周齡正常血壓對(duì)照組WKY大鼠相比，SHR組NF-κB蛋白與WKY組比較，核表達(dá)明顯增多(P＜0.05)，SHR+QCH

15、組、SHR+QCL組和SHR+Tel組表達(dá)較SHR組均減少(P＜0.05)，SHR+QCH組與SHR+QCL組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但和SHR+Tel組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　6.實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)心肌組織中肥厚基因的ANP，BNPmRNA的表達(dá)水平的比較
　　(1)與20周齡正常血壓對(duì)照組WKY大鼠相比，SHR組大鼠ANPmRNA與WKY組比較表達(dá)明顯增多(P＜0.05)，SHR

16、+QCH組、SHR+QCL組和SHR+Tel組ANPmRNA表達(dá)較SHR組均減少(P＜0.05);SHR+QCH組與SHR+QCL組差異較顯著(P＜0.05)，但和SHR+Tel組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　(2)與20周齡正常血壓對(duì)照組WKY大鼠相比，SHR組大鼠BNPmRNA與WKY組比較表達(dá)明顯增多(P＜0.05)，SHR+QCH組、SHR+QCL組和SHR+Tel組BNPmRNA表達(dá)較SHR組均減少(P＜0.

17、05);SHR+QCH組與SHR+QCL組差異較顯著(P＜0.05)，但和SHR+Tel組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)芩丹膠囊對(duì)SHR大鼠心室肥厚有明顯的逆轉(zhuǎn)作用，其具體表現(xiàn)為:改善SHR大鼠心肌形態(tài)學(xué)指標(biāo)，降低心肌細(xì)胞的體積，改善心肌的超微結(jié)構(gòu)。
　　(2)芩丹膠囊具有PPARγ部分激動(dòng)劑的作用，改善心肌肥厚可能是通過(guò)部分激活PPAR-γ抑制NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)其下游肥厚基因AN

18、P，BNP的mRNA的表達(dá)。
　　第二部分槲皮素激活PPAR-γ對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚AP-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　研究背景：
　　高血壓病是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)心血管疾病之一，其并發(fā)癥心肌肥厚在世界范圍內(nèi)是導(dǎo)致心力衰竭和心臟猝死的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素;心肌肥厚反應(yīng)主要的特征包括心肌細(xì)胞的肥大，收縮蛋白含量的增加，以及胚胎基因如心房利鈉肽(ANP)和腦鈉肽(BNP)的再表達(dá)。在各種心臟疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，心肌肥

19、厚早期是對(duì)各種心臟疾病血壓升高的一種適應(yīng)性反應(yīng)，是一種慢性代償機(jī)制;但是持續(xù)的細(xì)胞外信號(hào)刺激會(huì)導(dǎo)致心肌重塑而最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生。
　　過(guò)氧化物酶增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferater-activated receptor γ，PPAR-γ）是一類配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，在逆轉(zhuǎn)高血壓心室肥厚的過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用，在相關(guān)配體的激動(dòng)下，PPAR-γ能抑制心肌肥厚基因的表達(dá)，對(duì)高血壓心室肥厚引起的

20、心力衰竭起著預(yù)防和治療的作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，AP-1(activator protein-1)的激活在心肌肥厚的發(fā)展過(guò)程中的作用引起了廣泛的關(guān)注，AP-1家族成員中以C-Jun及C-Fos為主，且以C-Jun/C-Fos異二聚體形式的AP-1生物學(xué)活性最強(qiáng)，可參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞增殖，分化，轉(zhuǎn)化反應(yīng)的過(guò)程。在心血管的疾病中，AP-1是心肌肥厚中重要的轉(zhuǎn)錄因子，它調(diào)控的心肌肥厚反應(yīng)基因包括心鈉肽(ANP)、腦鈉肽(BNP)等心肌早期應(yīng)答基因

21、。實(shí)驗(yàn)研究表明，過(guò)量表達(dá)c-Jun的顯形負(fù)突變(dominant negative mutation)可以抑制ET-1和PE誘導(dǎo)的涉及AP-1的活性、蛋白合成、肌細(xì)胞生長(zhǎng)、ANP、BNP基因的表達(dá)等一系列心肌肥厚的變化，這些方面都說(shuō)明AP-1在調(diào)控心肌肥厚中起到了重要的作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)PPAR-γ可通過(guò)DNA依賴的方式抑制激活蛋白-1(AP-1)介導(dǎo)的信號(hào)通路。
　　槲皮素(3，3'，4'，5，7-pentahydroxyfl

22、avone，Que)，是生物黃酮類化合物，廣泛存在于自然界中，在調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)功能方面有良好的發(fā)展前景。槲皮素是芩丹膠囊中桑寄生的有效成分，具有良好的降壓作用，同時(shí)還具有抗氧化、抗血栓、抗炎、減輕心肌肥厚等多種心血管保護(hù)作用。近期研究表明，黃酮類可以通過(guò)激活了過(guò)氧化物酶體增殖物γ抑制在大鼠巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的環(huán)氧酶和一氧化氮合酶的活動(dòng)。本研究通過(guò)研究槲皮素對(duì)SHR大鼠心肌組織的病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的觀察，以及應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(real-ti

23、me PCR)和免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry)檢測(cè)PPAR-γ和AP-1(C-Jun，C-Fos)蛋白及mRNA表達(dá)的改變，以及對(duì)下游肥厚基因ANP、BNP的mRNA表達(dá)的影響，探討槲皮素對(duì)改善自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)心室肥厚的作用機(jī)制，為槲皮素治療高血壓心室肥厚的臨床應(yīng)用提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：
　　1.觀察槲皮素對(duì)SHR

24、大鼠心肌形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的改變，及對(duì)大鼠血壓和心動(dòng)超聲的影響，探討槲皮素抑制SHR大鼠心肌肥厚的療效。
　　2.探討槲皮素在抑制SHR大鼠心肌肥厚對(duì)PPAR-γ和AP-1(C-Jun，C-Fos)的蛋白的表達(dá)以及下游基因ANP、BNP的mRNA表達(dá)的影響，探討槲皮素抑制SHR大鼠心肌肥厚的信號(hào)調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1.研究對(duì)象:8周齡雄性SHR大鼠24只和8周齡Wistar-Kyoto大鼠(WKY)8只。隨機(jī)分為

25、4組，每組8只:
　　(1)WKY對(duì)照組;
　　(2)SHR對(duì)照組;
　　(3)SHR+槲皮素高劑量組（SHR+QH;10mg.kg-1，溶于1ml的二甲基纖維素）;
　　(4)SHR+槲皮素低劑量組（SHR+QH;5mg.kg-1，溶于1ml的二甲基纖維素），WKY對(duì)照組和SHR對(duì)照組分別給予等量蒸餾水。
　　各組大鼠均灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥12周。末次給藥后禁食24h，不禁水。3％戊巴比妥鈉(30

26、mg/kg)腹腔注射麻醉后，進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
　　2.研究?jī)?nèi)容:
　　(1)每?jī)芍軠y(cè)量尾動(dòng)脈收縮壓(SBP)，每周稱取體質(zhì)量(BW)一次;
　　(2)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)行常規(guī)超聲心動(dòng)圖檢查;
　　(3)處死動(dòng)物后，稱取左心室質(zhì)量(LVM)，并計(jì)算左室相對(duì)質(zhì)量指數(shù)(LVM/BW);
　　(4)HE染色和Masson染色觀察大鼠心肌組織形態(tài)并測(cè)量大鼠心肌纖維直徑和進(jìn)行心肌組織間質(zhì)膠原定量;
　　(5)電鏡

27、觀察大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu);
　　(6)免疫組織化學(xué)測(cè)定心肌組織中PPAR-γ和AP-1(C-Jun，C-Fos)蛋白的表達(dá)及定位;
　　(7)實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)心肌組織中PPAR-γ和AP-1(C-Jun，C-Fos)，ANP、BNP的mRNA的表達(dá);
　　(8)Western-blot檢測(cè)大鼠心肌組織PPAR-γ和AP-1(C-Jun，C-Fos)的表達(dá)。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料統(tǒng)一采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤

28、表示，統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。兩個(gè)組之間的數(shù)據(jù)比較用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組之間的均數(shù)比較用單因素或多因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni post-hoc檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.各組大鼠治療前后收縮壓的動(dòng)態(tài)變化
　　與8周齡正常血壓對(duì)照組WKY大鼠比較，8周齡SHR各組大鼠血壓已經(jīng)明顯升高(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，SHR組大鼠收縮壓可呈持續(xù)升

29、高狀態(tài);與20周齡正常血壓的WKY組相比，20周齡SHR組大鼠收縮壓顯著增加(P＜0.05)。給藥第4周起，SHR+QH組、SHR+QL組大鼠的血壓與模型組SHR組相比均有下降，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。給藥7周到12周期間，槲皮素大劑量組較低劑量組血壓下降更為顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.左室相對(duì)質(zhì)量(LVM/BW)
　　與20周齡正常血壓對(duì)照組WKY大鼠相比，20周齡SHR組大鼠LVM/

30、BW明顯增加(P＜0.05)。與20周齡SHR組相比，SHR+QH組和SHR+QL組大鼠LVM/BW顯著減?。≒＜0.05）。兩兩比較分析，SHR+QH組與SHR+QL組差異較顯著(P＜0.05)。
　　3.超聲心動(dòng)圖檢測(cè)
　　與8周齡的WKY組比較，8周齡的SHR各組大鼠心室肥厚指標(biāo)IVSd，LVPWd均明顯增加(P＜0.05);與20周齡的SHR組相比較，20周齡SHR+QH組、SHR+QL組心室肥厚指標(biāo)IVSd，LVP

31、Wd等均降低(P＜0.05);20周齡SHR+QH組、SHR+QL組的LVIDd，MFS，E/A等指標(biāo)均明顯升高(P＜0.05)，提示心臟功能得到改善。
　　4.各組大鼠心肌組織切片光鏡下HE染色觀察
　　20周齡WKY組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，胞漿染色均勻，細(xì)胞核大小均一。SHR組大鼠則見(jiàn)心肌細(xì)胞排列紊亂，胞漿染色加深，且細(xì)胞核大小不規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)心肌纖維斷裂的現(xiàn)象。與20周齡SHR組大鼠相比，SHR+QH組和SHR+QL

32、組大鼠心肌細(xì)胞排列較為整齊，細(xì)胞內(nèi)心肌纖維斷裂情況已明顯好轉(zhuǎn)，細(xì)胞核偶見(jiàn)大小不規(guī)則。
　　5.大鼠心肌纖維直徑(MFD)的比較
　　與20周齡正常血壓對(duì)照組WKY大鼠相比，20周齡SHR組大鼠心肌纖維直徑明顯增加(P＜0.05)。與20周齡SHR組相比，SHR+QH組和SHR+QL組大鼠心肌纖維直徑顯著減小(P＜0.05)。兩兩比較分析，SHR+QH組與SHR+QL組差異較顯著（P＜0.05）。
　　6.各組大鼠心肌組

33、織超微結(jié)構(gòu)的觀察
　　電鏡下，20周齡WKY組表現(xiàn)為心肌細(xì)胞核仁清晰，線粒體、閏盤(pán)、Z線清楚完整，心肌纖維排列清晰、整齊，間質(zhì)纖維無(wú)增生，細(xì)胞核染色質(zhì)分布較均勻，無(wú)膠原分泌。20周齡SHR組表現(xiàn)為線粒體嚴(yán)重腫脹，嵴消失斷裂，肌絲排列紊亂，閏盤(pán)及Z線不清，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)大，大量的膠原纖維增生成點(diǎn)片狀，部分心肌細(xì)胞核可見(jiàn)染色質(zhì)邊集的早期凋亡形態(tài)改變。SHR+QL組表現(xiàn)為心肌肌原纖維規(guī)則排列，閏盤(pán)整齊，細(xì)胞間質(zhì)水腫不明顯，肌漿網(wǎng)輕度擴(kuò)張，肌原

34、纖維整齊排列，有輕度線粒體腫脹，無(wú)明顯壞死。SHR+QH組表現(xiàn)為偶有點(diǎn)狀膠原纖維增生，肌絲排列相對(duì)整齊，較SHR組有明顯改善，膠原增生受到明顯抑制。
　　7.心肌組織切片光鏡下Masson染色觀察
　　光鏡下Masson染色顯示心肌細(xì)胞染色呈紅色，間質(zhì)膠原呈藍(lán)綠色。WKY組大鼠膠原組織分布較稀疏，相鄰細(xì)胞的膠原纖維網(wǎng)著色淡完好;SHR組心肌內(nèi)膠原組織明顯增多，圍繞心肌細(xì)胞的膠原纖維網(wǎng)排列紊亂、斷裂;與SHR組大鼠相比，SHR

35、+QH組和SHR+QL組膠原纖維明顯減少，膠原含量明顯下降，排列較規(guī)整，且呈一定的劑量依賴性。
　　8.大鼠心肌膠原面積百分比(VFC)比較
　　與20周齡正常血壓對(duì)照組WKY大鼠相比，20周齡SHR組大鼠心肌膠原面積百分比明顯增加(P＜0.05)。與SHR組相比，20周齡SHR+QH組和SHR+QL組大鼠心肌膠原面積百分比顯著減少(P＜0.05)，兩兩比較分析，SHR+QH組與SHR+QL組差異較顯著(P＜0.05)。

36、r>　　9.心肌組織免疫組織化學(xué)PPAR-γ、AP-1(C-Jun，C-Fos)蛋白表達(dá)水平比較
　　1)與20周齡正常WKY大鼠相比，SHR組PPAR-γ的核表達(dá)較WKY組明顯減少(P＜0.05);SHR+QH組、SHR+QL組較SHR組PPAR-γ核表達(dá)明顯增多(P＜0.05);兩兩比較分析，SHR+QH組與SHR+QL組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2)與20周齡正常血壓對(duì)照組WKY大鼠相比，SHR組與WK

37、Y組比較，AP-1(C-Jun，C-Fos)核表達(dá)明顯增多(P＜0.05)，SHR+QH組、SHR+QL組表達(dá)較SHR組均減少(P＜0.05);兩兩比較分析，SHR+QH組與SHR+QL組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　10.實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)心肌組織中肥厚基因的ANP，BNPmRNA的表達(dá)水平的比較
　　1)與20周齡正常血壓對(duì)照組WKY大鼠相比，SHR組PPAR-γ的mRNA表達(dá)量較WKY組明顯減少(P

38、＜0.05);與20周齡的SHR大鼠相比較，20周齡SHR+QH組和SHR+QL組較SHR組PPAR-γmRNA表達(dá)明顯增多(P＜0.05);兩兩比較分析，SHR+QH組與SHR+QL組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2)與20周齡正常WKY大鼠相比，SHR大鼠AP-1(C-Jun，C-Fos)，ANP，BNP的mRNA表達(dá)明顯增多(P＜0.05)，經(jīng)槲皮素治療12周后，SHR+QH組、SHR+QL組AP-1(C-

39、Jun，C-Fos)，ANP，BNP的mRNA表達(dá)較SHR組均明顯減少(P＜0.05);兩兩比較分析，SHR+QH組與SHR+QL組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　11.Western blot檢測(cè)分析PPAR-γ、AP-1(c-fos，c-jun)蛋白表達(dá)水平比較
　　1)與20周齡正常血壓對(duì)照組WKY大鼠相比，SHR組PPAR-γ的蛋白表達(dá)量較WKY組明顯減少(P＜0.05);與20周齡的SHR大鼠相比較

40、，20周齡SHR+QH組和SHR+QL組較SHR組PPAR-γ蛋白表達(dá)量明顯增多(P＜0.05);兩兩比較分析，SHR+QH組與SHR+QL組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2)與20周齡正常血壓對(duì)照組WKY大鼠相比，SHR組AP-1(C-Jun，C-Fos)蛋白表達(dá)量明顯增多(P＜0.01)，與20周齡的SHR大鼠相比較，20周齡SHR+QH組、SHR+QL組蛋白表達(dá)量較SHR組均減少(P＜0.05);兩兩比較分析，S

41、HR+QH組與SHR+QL組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)槲皮素對(duì)SHR大鼠心室肥厚有明顯的逆轉(zhuǎn)作用，其具體表現(xiàn)為:改善SHR大鼠心肌形態(tài)學(xué)指標(biāo)，降低心肌組織膠原含量，改善心肌的超微結(jié)構(gòu)和心功能的指標(biāo)。
　　(2)槲皮素具有PPAR-γ部分激動(dòng)劑的作用，在改善心肌肥厚的機(jī)制部分可能是激活PPAR-γ抑制肥厚轉(zhuǎn)錄因子AP-1(C-Jun，C-Fos)的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)其下游ANP、BNP的mR

42、NA的肥厚基因的表達(dá)。
　　第三部分槲皮素對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞肥厚PPAR-γ/AP-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　研究背景：
　　心肌肥大是心肌細(xì)胞對(duì)多種病理刺激如壓力過(guò)負(fù)荷、神經(jīng)體液因子以及心肌收縮蛋白基因突變等出現(xiàn)的一系列組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)的適應(yīng)性反應(yīng)，肥大特征表現(xiàn)主要包括心肌細(xì)胞體積增大，蛋白質(zhì)合成增加和胚胎期的表達(dá)基因再表達(dá)。一方面它是心臟早期的適應(yīng)性反應(yīng)，是一種慢性代償機(jī)制，許多神經(jīng)體液因子和心肌的

43、旁分泌因子參與到心肌肥厚的適應(yīng)性反應(yīng)中。另一方面它又是晚期心臟猝死和其他心血管事件的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。因此，逆轉(zhuǎn)高血壓心肌肥厚是防治高血壓及其靶器官損害的關(guān)鍵所在。
　　許多研究證實(shí)，心臟局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，而AngⅡ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)是起主要作用的生物活性物質(zhì)。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都顯示AngⅡ是致心肌細(xì)胞肥大的重要因子，血管緊張素Ⅱ可以直接促進(jìn)心臟和血管細(xì)胞生

44、長(zhǎng)，部分通過(guò)各種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白以及細(xì)胞因子的誘導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)包括核轉(zhuǎn)錄因子AP-1在內(nèi)很多信號(hào)分子在AngⅡ引發(fā)的心肌肥大反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，這些轉(zhuǎn)錄因子反過(guò)來(lái)又能調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞外基質(zhì)的生物合成。大量研究表明，參與構(gòu)成轉(zhuǎn)錄激活因子AP-1家族成員中以C-Jun及C-Fos為主，且以C-Jun/C-Fos異二聚體形式的AP-1生物學(xué)活性最強(qiáng)，并且直接抑制AP-1的活性可以直接降低心肌肥厚的發(fā)生。因此，當(dāng)原癌基因如c-fos和

45、c-jun作為初始應(yīng)答基因時(shí)，所編碼的產(chǎn)物Fos和Jun作為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控時(shí)因子和第三信使，通過(guò)一個(gè)亮氨酸拉鏈形成異源二聚體，與位于5'端上游調(diào)控區(qū)的AP-1位點(diǎn)（TGACTGA保守序列）結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)次級(jí)應(yīng)答基因如心房利尿鈉因子(ANF)、腦鈉肽(BNP)轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增加，蛋白表型向胚胎型轉(zhuǎn)化等心肌肥厚的特征性變化。因此，對(duì)心肌肥大信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的深入認(rèn)識(shí)，不僅有助于闡明心肌肥厚的細(xì)胞分子機(jī)制，而且為心肌肥厚

46、的防治提供新的策略。
　　槲皮素（3，3'，4'，5，7-pentahydroxyflavone，Que），是自然界中分布最廣的生物黃酮類化合物。槲皮素是芩丹膠囊中桑寄生的有效成分，我們前期的實(shí)驗(yàn)表明槲皮素能夠通過(guò)TGF-β1/Smad2信號(hào)通路改善TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的增殖。同時(shí)，我們的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明槲皮素能有效的抑制SHR大鼠心肌肥厚的發(fā)生，但是它對(duì)心臟的保護(hù)作用的靶點(diǎn)和細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還沒(méi)有完全的闡述清楚。因此

47、，本研究擬進(jìn)一步探明槲皮素在抑制心肌肥厚的過(guò)程中的相關(guān)信號(hào)通路。我們通過(guò)檢測(cè)槲皮素對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞肥厚的影響，應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)PPAR-γ，AP-1(C-Fos，C-Jun)蛋白的表達(dá)。同時(shí)，采用siRNA阻斷PPAR-γ蛋白的表達(dá)，應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)ANP，BNPmRNA表達(dá)情況以及western blot檢測(cè)C-Fos，C-Jun蛋白表達(dá)的改變，探討槲皮素抑制AngⅡ誘導(dǎo)的H9C2心肌肥厚的生物活性的途

48、徑，為其臨床防治高血壓性心肌肥厚提供科學(xué)依據(jù)。
　　目的：
　　1.本研究通過(guò)建立血管緊張素Ⅱ誘發(fā)的大鼠H9C2心肌細(xì)胞肥厚模型，考察槲皮素對(duì)心肌細(xì)胞表面積、[3H]-亮氨酸的摻入測(cè)定的影響。
　　2.通過(guò)siRNA阻斷心肌細(xì)胞的PPAR-γ途徑，考察槲皮素對(duì)轉(zhuǎn)錄因子C-Fos，C-Jun的蛋白表達(dá)及心肌肥厚特異性指標(biāo)ANP和BNPmRNA表達(dá)的影響，探討槲皮素抑制心肌肥厚的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.

49、常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞H9C2至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期備用，構(gòu)建血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9C2肥大模型，加入不同濃度的槲皮素，孵育一定時(shí)間。
　　2.采用相差顯微鏡觀察細(xì)胞大小，軟件分析測(cè)量心肌細(xì)胞表面積，[3H]-亮氨酸摻入法測(cè)定心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率。
　　3.細(xì)胞免疫熒光法測(cè)定PPAR-γ、C-Fos及C-Jun的蛋白水平及其細(xì)胞內(nèi)的定位。
　　4.根據(jù)GenebanK中PPAR-γ的序列號(hào)，設(shè)計(jì)并化學(xué)合成PPAR-

50、γsiRNA和沒(méi)有明顯同源性的非特異性陰性對(duì)照NCsiRNA。
　　5.常規(guī)培養(yǎng)H9C2細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，種于六孔板中，將實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染PPAR-γ特異性siRNA），陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染PPAR-γ陰性對(duì)照siRNA），空白對(duì)照組（不轉(zhuǎn)染任何siRNA，余試劑與其他兩組相同），進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
　　6.采用Western-blot技術(shù)分別檢測(cè)三組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后PPAR-γ蛋白的表達(dá)水平，以檢測(cè)siRNA對(duì)PPAR-γ的阻斷效率。<

51、br>　　7.細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，槲皮素與AngⅡ細(xì)胞共培養(yǎng)，Western-blot法檢測(cè)C-Fos，C-Jun的蛋白表達(dá)水平，RT-PCR法檢測(cè)心肌肥厚基因ANP、BNP的mRNA表達(dá)水平。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:計(jì)量資料統(tǒng)一采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。兩個(gè)組之間的數(shù)據(jù)比較用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組之間的均數(shù)比較用單因素或多因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni post-hoc檢驗(yàn)。當(dāng)

52、P＜0.05，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的[3H]-亮氨酸摻入量測(cè)定
　　AngⅡ刺激H9C2細(xì)胞建立心肌細(xì)胞肥厚模型后，AngⅡ組的[3H]-亮氨酸摻入量與正常對(duì)照組相比較明顯升高（P＜0.01），但是在與槲皮素共培養(yǎng)后，[3H]-亮氨酸摻入量明顯降低(P＜0.01)，且其抑制蛋白合成速率作用呈劑量依賴性。
　　2.H9C2細(xì)胞表面積的測(cè)定
　　AngⅡ刺激H9C2細(xì)胞建立心肌細(xì)

53、胞肥厚模型后，AngⅡ組的H9C2細(xì)胞表面積與正常對(duì)照組相比較明顯升高(P＜0.01)，但是與槲皮素共培養(yǎng)后，AngⅡ+Que組H9C2細(xì)胞表面積明顯降低（P＜0.01）。
　　3.細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)
　　(1)與正常對(duì)照組相比，AngⅡ組H9C2心肌細(xì)胞免疫熒光法測(cè)定PPAR-γ的核表達(dá)較正常對(duì)照組明顯減少(P＜0.01);AngⅡ+Que組H9C2心肌細(xì)胞免疫熒光較AngⅡ組PPAR-γ核表達(dá)明顯增多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0

54、.01）;
　　(2)與正常對(duì)照組相比，AngⅡ組H9C2心肌細(xì)胞免疫熒光法測(cè)定C-Fos，C-Jun的核表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增多(P＜0.01);AngⅡ+Que組H9C2心肌細(xì)胞細(xì)胞免疫熒光較AngⅡ組的C-Fos，C-Jun核表達(dá)明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　4.Western blot檢測(cè)分析
　　(1)siRNA轉(zhuǎn)染24h后，與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組PPAR-γsiRNA組的PPAR-γ蛋白表

55、達(dá)水平明顯下調(diào)(P＜0.01)，與正常細(xì)胞組相比，陰性對(duì)照組NCPPAR-γsiRNA的表達(dá)與空白對(duì)照組則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.01)。
　　(2)siRNA轉(zhuǎn)染48h后，給予刺激AngⅡ和槲皮素的共培養(yǎng)后，與AngⅡ組相比較，PPAR-γsiRNA組的C-Fos，C-Jun無(wú)明顯下降(P＞0.01)，陰性對(duì)照組NCPPAR-γsiRNA與AngⅡ組比較則明顯下降(P＜0.01)。
　　5.RT-PCR檢測(cè)
　　(1)

56、siRNA轉(zhuǎn)染24h后，與AngⅡ組相比，實(shí)驗(yàn)組PPAR-γsiRNA組的ANPmRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P＞0.01)，陰性對(duì)照組NCPPAR-γsiRNA的ANPmRNA表達(dá)與AngⅡ組比較則明顯下降(P＜0.01)。
　　(2)siRNA轉(zhuǎn)染24h后，與AngⅡ組相比，實(shí)驗(yàn)組PPAR-γsiRNA組的BNPmRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P＞0.01），陰性對(duì)照組NCPPAR-γsiRNA的BNPmRNA表達(dá)與AngⅡ組比較則