轉染BMP-2基因的脂肪干細胞移植對大鼠肺動脈高壓的影響及機制的研究.pdf

1、肺動脈高壓(pulmonary Arterial Hypertension，PAH)是以肺動脈壓力增高為特征的一類疾病，其發(fā)病機制至今仍不明了。已知血管重構是肺動脈高壓的重要病理特征，其主要病理改變是血管平滑肌層增厚造成管腔狹窄、閉塞。肺血管重構可引起肺動脈壓力升高，肺血管阻力增大而加重右心室后負荷，嚴重時導致右室肥厚、心力衰竭甚至死亡。延緩肺血管重構，改善心肺功能是藥物治療肺動脈高壓，提高患者生存率的關鍵靶點。
　　骨形成蛋白(

2、Bone morphogenetic proteins，BMPs)是轉化生長因子(Transforming Growth Factor，TGF)超家族成員之一。BMP可結合位于細胞膜上的絲氨酸/絡氨酸受體復合物（由BMPR-Ⅰ和BMPR-Ⅱ組成，進而磷酸化激活胞內(nèi)Smad信號分子，SmadS入核啟動下游基因表達。研究發(fā)現(xiàn)，骨形成蛋白Ⅱ型受體(BMPR-Ⅱ)突變是導致遺傳性肺動脈高壓的主要發(fā)病因素，也發(fā)現(xiàn)于25％左右的特發(fā)性肺動脈高壓患者

3、。在低氧誘導和野百合堿注射誘導的肺動脈高壓動物模型也發(fā)現(xiàn)BMPR-Ⅱ表達下調(diào)，BMP信號通路功能受損。因此，BMP信號通路被認為是PAH發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)節(jié)通路，其中的BMP-2信號通路可恢復細胞凋亡和增殖的平衡狀態(tài)，顯著改善肺血管重構，在細胞凋亡、增殖和轉化中擔當著重要的調(diào)控作用。研究表明，BMP-2信號是維持內(nèi)皮細胞正常功能的重要因素。
　　脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞(Adipose Derived Stromal Cells，

4、ADSCs)是一種來源于脂肪可以向中胚層多種細胞誘導分化的多能干細胞，因其取材簡單，創(chuàng)傷小，少量脂肪組織即可獲取大量細胞，體外培養(yǎng)方便，擴增容易而倍受研究者的關注，而且體外研究指出ADSCs可以分泌大量的促血管新生的細胞因子如肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)，血管內(nèi)皮生長因子(Vascular EndothelialGrowth Factor，VEGF)等。將ADSCS用于缺血性疾病取得了滿意的

5、結果，更有研究將該種細胞用于肺損傷模型，如肺氣腫的動物模型，依靠ADSCs的多向分化功能和/或其分泌作用增加肺組織的血管及腺泡的生成和修復，從而改善了肺組織的血流灌注和換氣功能。
　　本研究以此為切入點，將ADSCs與BMP-2相結合，通過對大鼠野百合堿誘導的肺動脈高壓治療及機制的探討，以證實轉染BMP-2基因ADSCs細胞移植在減少肺血管重構、減輕炎癥反應、修復肺組織損傷方面所起的作用。
　　材料和方法：
　　雄性成

6、年SD大鼠購于中國醫(yī)科大學動物實驗中心，8-10周齡，體重220-250g，10％水合氯醛0.3ml/100g腹腔麻醉。
　　實驗一:于嚴格無菌條件下取大鼠腹股溝脂肪組織，剪碎后用膠原酶消化，反復過濾離心獲取ADSCS，體外培養(yǎng)觀察細胞形態(tài)，并進行表型和功能鑒定。將構建的慢病毒eGFP-BMP-2基因載體轉染ADSCs，熒光顯微鏡下觀察轉染情況，檢測細胞的BMP-2蛋白分泌和表達情況，檢測細胞的遷移、增殖能力。
　　實驗二:

7、雄性Sprague-Dawley大鼠32只，隨機均分為四組，每組8只:正常對照組（C組）、肺動脈高壓組（MCT組）、脂肪間充質(zhì)干細胞治療組(ADSCs)、轉染BMP2基因組（BMP2組）。MCT組、ADSCs和BMP2組組一次性腹腔注射MCT60mg/Kg，C組經(jīng)腹腔注射相同體積的生理鹽水，兩周后ADMSC組經(jīng)右頸外靜脈一次性給予ADMSC5×106/1ml，C組和PAH組經(jīng)左頸外靜脈一次性給予1ml的生理鹽水。于ADMSC移植后2W，

8、右心導管法測定大鼠的肺動脈平均壓(MPAP)、右心室肥厚指數(shù)[RVHI％=右心室游離壁(RV)重量/左心室+室間隔(LV+S)重量]、并運用ipp6.0圖像分析軟件分析肺組織切片，測定直徑在100-200μm范圍的肺小動脈管壁厚度(WT)占動脈外徑(ED)的百分比(WT％)及管壁面積(WA)占血管總面積的百分比(WA％)。熒光顯微鏡觀察帶GFP標記的ADMSC在肺內(nèi)的定植。Western blot和Real time-PCR檢測肺組織B

9、MP-2、BMPR2、Smad1、survivin和P21的mRNA與蛋白表達。
　　實驗數(shù)據(jù)結果以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS16.0進行統(tǒng)計分析，不同組間參數(shù)比較采用t檢驗或單因素方差分析，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　實驗一:大鼠腹股溝脂肪組織經(jīng)過膠原酶消化后，72小時細胞貼壁，成纖維細胞樣生長，原代細胞分離種植后7-10天融合至90％左右可以傳代，傳代后細胞生長旺盛，約2-3天即可再次傳

10、代。流式細胞儀測定細胞表面免疫表型，CD29，CD90，CD105陽性，CD14，CD45基本陰性。油紅染色鑒定成脂誘導14天后的細胞可見細胞漿內(nèi)脂滴染成紅色，茜素紅染色鑒定成骨誘導14天的ADSCS，細胞變長，聚集，細胞漿可見棕紅色的鈣化沉積顆粒。慢病毒eGFP-BMP-2基因轉染ADSCs后，倒置相差熒光顯微鏡下可見轉染細胞表達綠色熒光，轉BMP-2基因EPC的BMP-2蛋白分泌和表達明顯增加(P＜0.05)。轉染后細胞MTT及tr

11、answell活性檢測發(fā)現(xiàn)轉染細胞與空載及未轉染組生長曲線及遷移能力，沒有明顯差異(P＞0.05)。
　　實驗二:轉BMP-2基因EPC移植后可定位于肺組織。與MCT組相比，ADSCs組和轉基因ADSCs組可明顯改善肺組織的病理學改變，治療組大鼠的MPAP、RVHI％、WA％和WT％明顯降低，轉基因ADSCs組降低更為明顯，轉基因ADSCs組的肺組織可檢測到BMP-2和BMPR2蛋白和mRNA表達明顯增加(P＜0.01)，Smad

12、1 mRNA表達明顯增加(P＜0.01)，并且轉基因ADSCs組與單純ADSCs組比較可檢測到更多的P21蛋白表達，及更少的survivin蛋白表達(P＜0.05)。
　　結論：
　　1、慢病毒eGFP-BMP-2基因轉染ADSCs后，可增加ADSCs分泌和表達BMP-2蛋白，對其增殖活性和遷移能力無明顯影響。
　　2、轉BMP-2基因ADSCs移植后可定位于肺損傷部位，使肺組織的BMP-2蛋白和mRNA表達增加，進而