人肝細(xì)胞生長因子基因轉(zhuǎn)移對大鼠試驗性肺動脈高壓的影響.pdf

1、第一部分野百合堿復(fù)合左肺切除誘發(fā)的大鼠肺動脈結(jié)構(gòu)重建病理形態(tài)學(xué)觀察 目的:觀察野百合堿(MCT)復(fù)合單肺切除誘發(fā)的實驗性肺動脈重建的病理形態(tài)學(xué)特征。 方法:16只雄性Lewis大鼠隨機(jī)分為二組(n=8)：野百合堿+左肺切除組(M+P組)，大鼠行左肺切除，7天后皮下注射野百合堿(monocrotaline，MCT)60mg/kg；對照組(CON組)，大鼠僅行假手術(shù)處理。大鼠于左肺切除復(fù)合MCT皮下注射后28天檢測肺動脈壓、

2、右心室重量，同時觀察右肺動脈病理形態(tài)學(xué)改變。通過計算肌型、部分肌型肺小動脈在直徑為15-50μm的外周肺小動脈中所占的比例評價其肌型化程度。以光鏡下每1mm2面積內(nèi)Ⅷ因子標(biāo)記陽性的直徑小于100μm的肺血管數(shù)評價肺內(nèi)微血管密度。肺血管內(nèi)皮凋亡通過Caspase-3免疫標(biāo)記來進(jìn)行檢測。 結(jié)果:與對照組相比，M+P組大鼠肺動脈壓力和RV/(LV+S)比值明顯增高(P＜0.01)。病理觀察顯示M+P組大鼠MCT注射后28天肌型肺小動脈

3、中膜明顯增厚，肺腺泡內(nèi)小動脈明顯肌化、內(nèi)膜增厚，對照組大鼠肺小動脈未見血管結(jié)構(gòu)重建。與對照組相比，M+P組大鼠肺內(nèi)肌型、部分肌型肺小動脈在直徑為15-50μm的外周肺小動脈中所占的比例增加了4倍以上，VOS評分顯示肺小動脈內(nèi)膜明顯增厚(P＜0.01)。與對照組相比，M+P組大鼠肺小動脈內(nèi)皮細(xì)胞壞死及內(nèi)彈力膜斷裂明顯。免疫組織化學(xué)顯示M+P組大鼠肺小動脈內(nèi)皮caspase-3呈強(qiáng)陽性表達(dá)，對照組肺小動脈內(nèi)皮caspase-3則呈弱陽性表達(dá)

4、。結(jié)論肺微血管密度減少、肺小動脈內(nèi)皮損傷、肌型肺小動脈中膜增厚和肺腺泡內(nèi)小動脈肌化、內(nèi)膜增厚是野百合堿復(fù)合左肺切除誘發(fā)的大鼠肺動脈高壓形成的病理基礎(chǔ)。 第二部分野百合堿復(fù)合左肺切除誘發(fā)的肺動脈高壓大鼠模型肺內(nèi)肝細(xì)胞生長因子及其受體的表達(dá) 目的:觀察野百合堿復(fù)合單肺切除誘發(fā)的肺動脈高壓大鼠肺內(nèi)肝細(xì)胞生長因子及其受體的表達(dá)。 方法:80只雄性Lewis大鼠隨機(jī)分為2組(n=40)，每組再隨機(jī)分為4個時間點(diǎn)(

5、n=10)。野百合堿+左肺切除組(M+P組)大鼠行左肺切除，7天后皮下注射野百合堿；對照組(CON組)僅行假手術(shù)處理。各組動物分別于手術(shù)后14、21、28、35天行肺動脈壓、心室重量檢測，肺動脈病理形態(tài)學(xué)觀察，RT-PCR法檢測肺組織HGF、c-Met、eNOS表達(dá)水平，免疫印跡法檢測肺組織HGF、c-Met表達(dá)水平，ELISA法檢測肺組織ET-1、TGF-β含量，免疫組織化學(xué)法檢測肺內(nèi)eNOS和Ⅷ因子表達(dá)。 結(jié)果:與對照組大鼠

6、相比，M+P組大鼠左肺切除復(fù)合野百合堿皮下注射后28天發(fā)生了明顯的肺動脈高壓和右室肥厚，伴肺動脈中膜明顯肥厚、肺小動脈肌化。與對照組相比，M+P組大鼠肺組織HGFmRNA及其蛋白表達(dá)水平呈時間依賴性明顯下調(diào)(P均＜0.01)。但兩組大鼠肺組織c-MetmRNA及其蛋白表達(dá)各時間點(diǎn)均無明顯差異(P均＞0.05)。RT-PCR和免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示M+P組大鼠肺內(nèi)eNOS表達(dá)水平明顯下調(diào)，與對照組相比有顯著差異(P＜0.01)。ELlS

7、A檢測結(jié)果顯示M+P組大鼠肺組織TGF-β和ET-1含量明顯升高，并呈時間依賴性，對照組大鼠未見改變(P均＜0.01)。相關(guān)分析顯示，肺組織HGFmRNA表達(dá)水平分別與平均肺動脈壓、RV/S+LV比值、50-100μm和100-150μm肌型肺動脈中膜相對厚度、肺組織TGF-β、ET-1含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P均＜0.01)，與肺內(nèi)eNOSmRNA表達(dá)水平、肺血管密度改變存在顯著正相關(guān)(r=0.90938，P＜0.01；r=0.843，

8、P＜0.01)。 結(jié)論:肺內(nèi)HGF表達(dá)下調(diào)可能在野百合堿復(fù)合單肺切除誘導(dǎo)的大鼠肺血管重建中起重要作用；肺內(nèi)HGF的表達(dá)下調(diào)與肺內(nèi)eNOS的表達(dá)上調(diào)、ET-1表達(dá)的下調(diào)密切相關(guān)，可能在促進(jìn)肺動脈高壓大鼠肺血管內(nèi)皮功能紊亂的發(fā)生中起重要作用。肺動脈高壓時肺內(nèi)TGF-β合成的增加可能是導(dǎo)致肺內(nèi)HGF表達(dá)下調(diào)的重要原因。 第三部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的大鼠肺內(nèi)基因轉(zhuǎn)移試驗一Lewis大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒

9、定 目的:用Percoll分離液密度梯度分離和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法分離和培養(yǎng)大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并對分離、培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 方法:采用Percoll分離液(1.073g/L)密度梯度分離和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法來分離培養(yǎng)Lewis大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。MSCs細(xì)胞鑒定：差相顯微鏡觀察MSCs的形態(tài)學(xué)特征；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記抗原CD29、CD90、CD34和CD45的表達(dá)率；蘇丹Ⅲ染色檢

10、測MSCs成脂細(xì)胞分化；堿性磷酸酶染色和茜素紅染色檢測MSCs成骨分化。 結(jié)果:(略）?！　〗Y(jié)論:采用Percoll分離液(1.073g/L)密度梯度分離和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法能夠成功分離和培養(yǎng)大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。第5代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞保持分化潛能。 試驗二骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的大鼠肺內(nèi)基因轉(zhuǎn)移 目的:觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)介導(dǎo)的大鼠肺內(nèi)β-半乳糖苷酶(lacZ)基因轉(zhuǎn)移并在肺內(nèi)表達(dá)

11、外源基因的可行性。 方法:對原代培養(yǎng)的Lewis大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行DAPI熒光染色標(biāo)記或者轉(zhuǎn)染β-半乳糖苷酶表達(dá)載體(pSV-bGal)，再將轉(zhuǎn)染后或者熒光標(biāo)記的MSCs(5×105細(xì)胞/每只大鼠)經(jīng)頸靜脈輸入同基因背景的受體Lewis鼠體內(nèi)(n=10)，48h和8w后處死大鼠(每時點(diǎn)5只大鼠)，切取大鼠肺臟、脾臟、肝臟、腎臟、骨骼肌標(biāo)本，熒光顯微鏡觀察熒光標(biāo)記的移植細(xì)胞，將肺組織與X-gal色素原一起孵育檢測Lac-Z基

12、因的表達(dá)產(chǎn)物。 結(jié)果:靜脈輸入細(xì)胞后48h及8周，脾臟、胰、肝臟、腎臟、僅見少量熒光標(biāo)記的MSCs，骨骼肌未見熒光標(biāo)記的MSCs，但肺內(nèi)可檢測到大量熒光標(biāo)記的MSCs，大部分的這些細(xì)胞主要位于肺間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)。經(jīng)頸靜脈輸入轉(zhuǎn)染了pSV-bGal的MSCs后48h及8w，肺組織標(biāo)本與X-gal色素原溶液一起孵育后，顯微鏡下可見大鼠肺內(nèi)散布著許多深藍(lán)色標(biāo)記的MSCs細(xì)胞，相反，脾臟、腎臟中則僅見少量深藍(lán)色標(biāo)記的MSC細(xì)胞，肝臟、骨骼

13、肌、胰腺組織未見深藍(lán)色標(biāo)記的MSC細(xì)胞。 結(jié)論:基于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的間接基因轉(zhuǎn)移是一種有效的可選擇性的在肺內(nèi)轉(zhuǎn)移外源基因的非病毒學(xué)方法。 第四部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的人肝細(xì)胞生長因子基因轉(zhuǎn)移對大鼠實驗性肺動脈高壓的影響研究 背景:(略） 方法:選擇7周齡雄性Lewis大鼠行左肺切除術(shù)，1周后皮下注射野百合堿，同時經(jīng)頸外靜脈注射3×105個經(jīng)過基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。16只Lew

14、is大鼠隨機(jī)分為2組(每組8只)。HGF組大鼠經(jīng)頸外靜脈注射轉(zhuǎn)染了pUC-SR/HGF表達(dá)載體的MSCs。對照組(CON組)大鼠經(jīng)頸外靜脈注射轉(zhuǎn)染了pUC-SRα表達(dá)載體的MSCs。細(xì)胞移植后28天分別進(jìn)行肺動脈壓、心室重量檢測和肺動脈病理形態(tài)學(xué)觀察。肺組織大鼠HGF(rHGF)、人HGF(hHGF)、c-Met、eNOS表達(dá)水平采用RT-PCR法進(jìn)行檢測，肺組織rHGF、hHGF、c-Met蛋白表達(dá)水平采用免疫印跡法(Westernb

15、lot)檢測，c-Met蛋白磷酸化采用免疫共沉淀法檢測，肺組織ET-1、TGF-β、hHGF含量采用ELISA法檢測，肺內(nèi)caspase-3和Ⅷ因子表達(dá)采用免疫組織化學(xué)法檢測。 結(jié)果:與對照組相比，HGF組模型大鼠注射經(jīng)pUC-SR/HGF轉(zhuǎn)染的MSCs細(xì)胞后28天，肺動脈壓、右室肥厚、肺動脈中膜肥厚、外周肺小動脈肌化明顯減輕，其肺動脈內(nèi)膜增厚(血管阻塞評分)也明顯輕于對照組(P均＜0.01)。與對照組相比，HGF組肺內(nèi)毛細(xì)血管

16、密度(Ⅷ因子標(biāo)記陽性的毛細(xì)血管數(shù)/mm2)顯著增加(P＜0.01)。RT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示HGF組大鼠肺內(nèi)rHGFmRNA及其蛋白表達(dá)水平均明顯升高，與對照組相比有顯著差異(P均＜0.01)。同樣，HGF組eNOSmRNA及其蛋白表達(dá)水平也明顯高于對照組(P均＜0.01)。HGF組大鼠細(xì)胞移植后28天可檢測到肺內(nèi)hHGFmRNA及其蛋白的明顯表達(dá)，與之相比，對照組大鼠在細(xì)胞移植后未能檢測到hHGFmRNA及其蛋白的