eNOS基因轉(zhuǎn)移聯(lián)合西地那非對(duì)大鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓的預(yù)防作用.pdf

1、本文擬建立大鼠低氧性PH模型，應(yīng)用攜帶人類eNOS基因的重組腺病毒AdCMVceNOS基因?qū)耄⒙?lián)合口服枸櫞酸西地那非，通過(guò)血流動(dòng)力學(xué)、組織學(xué)、生化學(xué)、分子生物學(xué)等方法，研究腺病毒介導(dǎo)eNOS基因轉(zhuǎn)移聯(lián)合西地那非，預(yù)防急性低氧性肺血管收縮(HPV)和慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓(CHPH)的可行性、療效及相關(guān)毒副作用，為此法用于臨床奠定理論基礎(chǔ)，為PH治療開(kāi)創(chuàng)出更為安全有效的新方法。 研究材料： 1、實(shí)驗(yàn)材料： 重組腺

2、病毒載體AdCMVceNOS病毒DNA 由Dr Robert Gerard惠贈(zèng)重組腺病毒載體AdCMVLacZ 東方肝膽醫(yī)院惠贈(zèng)pXC1載體加拿大Microbix Biosystems公司腺病毒E1區(qū)轉(zhuǎn)化人胚胎腎細(xì)胞株293 加拿大Microbix Biosystems公司引物Vt01、Vt02、Vt001和Vt002 Takara公司合成I125-cGMP放射免疫試劑盒上海中醫(yī)藥大學(xué)小鼠抗人eNOS單克隆抗體 BD公司一氧化氮試劑盒南

3、京建成生物工程研究所免疫組化試劑盒北京中杉生物技術(shù)公司彈力纖維染色試劑盒北京中杉生物技術(shù)公司ECL試劑盒北京中杉生物技術(shù)公司X-gal(5-溴-4-氯-β-吲哚-p-半乳糖苷) Takara公司枸櫞酸西地那非輝瑞制藥公司10％氮氧混合氣沈陽(yáng)液化空氣有限公司100％氮?dú)馍蜿?yáng)液化空氣有限公司。 2、實(shí)驗(yàn)設(shè)備PCR儀德國(guó)BIOMETRA公司N02120MAX21g電子天平 NAVIGATOR公司TDL-40B離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器有限

4、公司721型分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司GC-2016放射免疫計(jì)數(shù)器科大創(chuàng)新股份有限公司TKR-200C小動(dòng)物呼吸機(jī)江西特力麻醉呼吸設(shè)備有限公司。 3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠126只沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 研究方法： 1、第一部分： (1)AdCMVceNOS病毒DNA用脂質(zhì)體法體外轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，且在細(xì)胞內(nèi)部包裝。經(jīng)PCR鑒定后在293細(xì)胞株內(nèi)擴(kuò)增，繼而經(jīng)CsC1密度梯度離心純化及TCID5

5、0法測(cè)定滴度。 (2)雄性Wistar大鼠54只，隨機(jī)分為對(duì)照(C)組、Ad-Lacz組和Ad-eNOS組，每組18只。分別應(yīng)用病毒保存液、5×10<'9>PFU/mlAdCMVLacZ和AdCMVceNOS各600u1經(jīng)氣管導(dǎo)管注入大鼠肺臟。3、5和17天后，每組各取6只，測(cè)定HR和血壓，并行肺組織X-gal染色、eNOS免疫組化染色、HE染色、eNOS Westemblot檢測(cè)及cGMP和NO含量測(cè)定。轉(zhuǎn)染病毒后5天的大鼠，

6、同時(shí)行肝、脾、腎臟的組織化學(xué)染色。 2、第二部分： 雄性Wistar大鼠36只，隨機(jī)分為常氧(N)組、低氧(H)組、低氧LacZ(H-LacZ)組、低氧eNOS(H-eNOS)組、低氧西地那非(H-S)組和低氧eNOS-西地那非(H-eNOS-S)組，每組6只。首先經(jīng)氣道轉(zhuǎn)基因(N、H和H-S組應(yīng)用病毒保存液，H-LacZ組應(yīng)用5×10<'9>PFU/ml AdCMVLacZ 600μl，H-eNOS和H-eNOS-S組

7、應(yīng)用5×10<'9>PFU/ml AdCMVceNOS 600gl經(jīng)氣管導(dǎo)管注入大鼠肺臟)。3天后，N組常氧(吸入空氣)30min，其它組大鼠急性低氧(吸入10％氧氣)30min。H-S和H-eNOS-S組大鼠在低氧前30min，應(yīng)用0.3％西地那非25mg/kg灌胃，其它組大鼠灌入等量生理鹽水(8.33ml/kg)。低氧結(jié)束后，測(cè)定大鼠體循環(huán)血壓(SAP)、HR和MPAP，動(dòng)脈血?dú)夥治?，檢測(cè)肺組織cGMP、NO含量。 3、第三

8、部分： 雄性Wistar大鼠36只，隨機(jī)分為常氧(N)組、低氧(H)組、低氧LacZ(H-Lacz)組、低氧eNOS(H-eNOS)組、低氧西地那非(H-S)組和低氧eNOS-西地那非(H-eNOS-S)組，每組6只。首先經(jīng)氣道轉(zhuǎn)基因(N、H和H-S組應(yīng)用病毒保存液，H-LacZ組應(yīng)用5×10<'9>PFU/ml AdcMVLacz 600μl，H-eNOS和H-eNOS-S組應(yīng)用5×10<'9>PFU/ml AdCMVceNO

9、S 600μl經(jīng)氣管導(dǎo)管注入大鼠肺臟)。之后常氧飼養(yǎng)3天，每日灌胃1次。3天后，N組常氧處理(吸入空氣)2周，其它組慢性常壓低氧處理(吸入10％氧氣，每天8h)2周，并于每日低氧前30min灌胃。H-S和H-eNOS-S組應(yīng)用的灌胃溶液含0.3％枸櫞酸西地那非25mg/kg，其余各組灌入等容量生理鹽水(8.33ml/kg)。低氧結(jié)束后，行血?jiǎng)恿W(xué)檢測(cè)、肺血管結(jié)構(gòu)重塑指標(biāo)檢測(cè)、右室肥大指標(biāo)檢測(cè)、Hct檢測(cè)，并行肺組織eNOS Westem

10、blot檢測(cè)及cGMP和NO含量測(cè)定。 研究結(jié)果： 1、第一部分： (1)AdCMVceNOS病毒DNA經(jīng)脂質(zhì)體法成功導(dǎo)入293細(xì)胞內(nèi)，并包裝成完整的病毒顆粒。經(jīng)PCR鑒定并確認(rèn)，擴(kuò)增后檢測(cè)滴度為1.58×10<'10>PFU/ml。 (2)Ad-eNOS組各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)肺組織eNOS蛋白、cGMP和NO含量均明顯高于C和Ad-LacZ組(p<0.01)。免疫組化顯示，eNOS轉(zhuǎn)基因表達(dá)分布于支氣管上皮、肺

11、泡細(xì)胞以及肺中、小血管內(nèi)皮。C和Ad-LacZ組各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，肺組織eNOS蛋白、cGMP和NO含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)，僅在肺內(nèi)大血管內(nèi)皮有內(nèi)源性eNOS蛋白表達(dá)； (3) 經(jīng)氣道注入重組腺病毒5天后，Ad-LacZ組大鼠肝、脾、腎臟未見(jiàn)外源LacZ基因表達(dá)。但有一只肺組織出現(xiàn)廣泛炎細(xì)胞浸潤(rùn)。 (4) 轉(zhuǎn)基因后同一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，三組大鼠體重(WT)、HR和SAP無(wú)明顯差異(p>0.05)。 2、第二部分：

12、 (1)大鼠急性低氧30min后，H-eNOS和H-S組MPAP明顯低于H和H-LacZ組(p<0.01)，明顯高于H-eNOS-S組和N組(p<0.01)，H-eNOS-S和N組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。 (2) 各低氧組SAP、PaO<,2>和PaCO<,2>明顯低于N組(p<0.05)，HR明顯高于N組(p<0.05)，且各低氧組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。 (3) N組大鼠肺組織NO含量，明顯高

13、于H、H-LacZ和H-S組，明顯低于H-eNOS和H-eNOS-S組(p<0.05)，且H、H-LacZ和H-S組間以及H-eNOS和H-eNOS-S組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。 (4)H和H-LacZ組大鼠肺組織cGMP含量明顯低于N組(p<0.05)，H-eNOS和H-S組明顯高于N組(p<0.05)，且明顯低于H-eNOS-S組(p<0.01)。 3、第三部分： (1) 各低氧組大鼠體重明顯低于N組

14、(p<0.01)，肺臟重量/體重比明顯高于N組(p<0.05)。所有大鼠HR、SAP、肝臟重量/體重比和腎臟重量/體重比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。 (2)低氧各組大鼠MPAP、肺小血管肌化指標(biāo)(CMA/MA)和右室肥厚指標(biāo)(RV/(Lv+s))均明顯高于N組(p<0.01)，H-eNOS與H-S組明顯低于H與H-LacZ組(p<0.01)，明顯高于H-eNOS-S組(p<0.05)。H與H-LacZ組間及H-eNOS與H-S

15、組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。 (3) H-eNOS、H-S和H-eNOS-S組Hct明顯高于N組(p<0.05)，明顯低于H和H-LacZ組(p<0.05)。 (4)H、H-LacZ和H-S組大鼠，肺組織eNOS蛋白含量明顯高于N組(p<0.01)，明顯低于H-eNOS和H-eNOS-S組(p<0.01)。 (5) N組大鼠，肺組織NO含量明顯高于H、H-LacZ和H-S組(p<0.05)，明顯低于H-eN

16、OS和H-eNOS-S組(p<0.01)。 (6) H-eNOS-S組大鼠，肺組織cGMP含量明顯高于其它各組(p<0.01)，N、H和H-LacZ組大鼠無(wú)明顯差別(p>0.05)，明顯低于H-eNOS和H-S組(p<0.01)。 研究結(jié)論： 1、重組腺病毒可介導(dǎo)eNOS基因在大鼠氣道高效表達(dá)，轉(zhuǎn)基因表達(dá)分布廣泛(于支氣管上皮和肺泡細(xì)胞，肺內(nèi)中、小血管內(nèi)皮亦有轉(zhuǎn)基因表達(dá))，靶向性高，并至少持續(xù)17天。外源eNOS

17、基因的表達(dá)，可使肺組織NO和cGMP產(chǎn)量明顯增高。 2、經(jīng)氣道轉(zhuǎn)移重組腺病毒，對(duì)大鼠生命體征無(wú)影響，但有引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)的可能，故應(yīng)在達(dá)到療效的同時(shí)，盡量控制病毒轉(zhuǎn)移的量或滴度。 3、急性低氧30min，可降低大鼠SAP，提高HR，并引發(fā)HPV，此病理過(guò)程與低氧引起肺組織NO/cGMP含量降低有關(guān)。 4、慢性低氧二周，可導(dǎo)致大鼠MPAP升高、肺血管結(jié)構(gòu)重塑、右室肥厚和Hct上升，伴肺組織內(nèi)eNOS表達(dá)上調(diào)、NO含