?？麖娦碾腃ardiactide純化工藝、藥效及藥理學研究.pdf

1、?？軌蛲ㄟ^刺細胞釋放?？舅剡M行捕食和防御。其中的一類毒素是被稱為海葵神經(jīng)毒素的多肽蛋白，它能與神經(jīng)元、心肌細胞等興奮性細胞上的離子通道發(fā)生特異性的結合，引起細胞內(nèi)離子濃度的變化，從而影響生物的生理功能。研究表明，很多作用于鈉離子通道的?？窠?jīng)毒素能夠?qū)Σ溉閯游锏男呐K產(chǎn)生正性變力作用，增強心肌的收縮能力。
　　 根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計的數(shù)據(jù)，每年死于心血管疾病的人數(shù)高達1660萬，占全世界死亡總?cè)藬?shù)的三分之一。心臟壓力負荷導致的

2、心力衰竭正嚴重危害著人類的身體健康，而目前用于治療心力衰竭的臨床藥物都存在一定的局限性，因此，一種新的療效好毒性小的抗心衰藥物的開發(fā)變得至關重要。本實驗室從側(cè)花?？鸄nthopleurin sp.中分離得到一種新的?？窠?jīng)毒素基因HK2a，利用基因工程手段，構建了海葵神經(jīng)毒素基因Hk2a的融合表達質(zhì)粒pTRX-Hk2a，HK2a在原核表達系統(tǒng)大腸桿菌中獲得了高效、可溶表達。初步的活性研究發(fā)現(xiàn)HK2a表達產(chǎn)物Cardiactide能夠增強

3、正常SD大鼠離體心房的心肌收縮能力。在實驗室前期工作的基礎上，本研究對具有我國自主知識產(chǎn)權的Cardiactide，進行了中試規(guī)模生產(chǎn)工藝、藥效學和藥理學的研究。
　　 基于損失最少、蛋白穩(wěn)定、能用于生產(chǎn)的前提，通過超聲破碎發(fā)酵菌體，采用親和層析、分子篩層析、酶切去除融合蛋白、進一步分子篩層析分離酶切后的目的蛋白、超濾濃縮和凍干等方法對中試規(guī)模發(fā)酵的表達產(chǎn)物進行了分離純化，優(yōu)化出了中試規(guī)模的最佳純化工藝方案，1L發(fā)酵菌液可以純化

4、出目的蛋白Cardiactide60mg，純度達95％以上。對工程菌進行的傳代遺傳穩(wěn)定性的研究結果表明工程菌株在傳代到105代時重組質(zhì)粒序列仍保持穩(wěn)定，重組蛋白Cardiactide表達水平與第1代菌株沒有顯著差別。
　　 以靜脈滴注1％戊巴比妥鈉誘導心衰模型，應用左心室插管技術測定急性心衰豚鼠血流動力學的變化，觀察Cardiactide對急性心衰豚鼠左心室功能的影響。實驗結果顯示，靜脈滴注不同濃度Cardiactide的生理鹽

5、水溶液，使急性心功能不全時的+dp/dtmax升高，并在225ug/kg左右作用達到峰值，表明Cardiactide靜脈滴注能使衰竭心肌的收縮性增強。但是，Cardiactide對豚鼠的心率有一定的影響，可引發(fā)心率不齊。
　　 實驗室前期工作發(fā)現(xiàn)，Cardiactide能夠有效的抑制心肌細胞上鈉離子通道的失活，通過增大鈉離子的內(nèi)流，介導細胞內(nèi)鈣離子的變化，從而起到正向肌力作用。本研究運用膜片鉗技術，發(fā)現(xiàn)Cardiactide也能

6、夠有效地抑制DRG細胞和ND7/23細胞上鈉離子通道的失活，通過增大鈉離子的內(nèi)流，引起交感神經(jīng)興奮，推測這可能是導致心率不齊癥狀的原因。
　　 綜上所述，本文在實驗室小試重組表達純化工藝的基礎上，建立了中試規(guī)模的Cardiactide的最佳純化方案，證實了表達Cardiactide的工程菌株的傳代穩(wěn)定性；運用急性心衰豚鼠模型證明了Cardiactide治療心力衰竭的藥效學活性，并應用膜片鉗技術，深入地研究了Cardiactide