人胚胎嗅鞘細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、純化及鑒定.pdf

1、研究背景脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)是一種常見(jiàn)的嚴(yán)重創(chuàng)傷，常導(dǎo)致相應(yīng)的脊髓、神經(jīng)功能障礙，具有相當(dāng)高的致殘率，給患者、家屬和社會(huì)帶來(lái)極大的痛苦和沉重的負(fù)擔(dān)。研究認(rèn)為導(dǎo)致?lián)p傷脊髓的結(jié)構(gòu)和功能難以恢復(fù)的主要原因是：脊髓損傷后局部微環(huán)境的變化不利于軸突的再生，而由此繼發(fā)的神經(jīng)傳導(dǎo)束連續(xù)性的中斷導(dǎo)致了臨床上各種癥狀的發(fā)生。嗅鞘細(xì)胞(OECs)兼具中樞和周圍兩個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特性，可表達(dá)和分泌多種細(xì)胞粘附分子及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因

2、子，對(duì)中樞神經(jīng)元軸突再生有著其它類型細(xì)胞難以比擬的的支持作用。本研究探討了人胚胎嗅鞘細(xì)胞(hOECs)的原代培養(yǎng)方法及其形態(tài)學(xué)特征，為下一步移植治療實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究提供了實(shí)驗(yàn)材料。 目的：探討應(yīng)用體外延遲差速貼壁法結(jié)合阿糖胞苷(Ara-C)抑制劑法對(duì)hOECs進(jìn)行分離純化的可行性，為SCI移植治療實(shí)驗(yàn)研究提供材料。 方法：取自然流產(chǎn)3-6個(gè)月人胚胎，在解剖顯微鏡下分離嗅球的嗅神經(jīng)層和顆粒層，采用原代培養(yǎng)的方法培養(yǎng)h

3、OECs；隨后應(yīng)用延遲差速貼壁法結(jié)合Am-C抑制劑法對(duì)hOECs進(jìn)行純化；并用形態(tài)學(xué)方法觀察其體外生長(zhǎng)特性；最后用P75和GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定hOECs的純度。 結(jié)果：利用此方法成功培養(yǎng)出hOECs。在培養(yǎng)hOECs同時(shí)，在顯微鏡下對(duì)培養(yǎng)純化的hOECs體外生長(zhǎng)特性進(jìn)行觀察，原代培養(yǎng)5天的hOECs胞體呈長(zhǎng)梭形，多極狀，立體感強(qiáng)，折光性好；8天后。胞體變大，突起變長(zhǎng)，并逐漸相互交織成網(wǎng)。14天后細(xì)胞主要表現(xiàn)為雙極或多

4、極形態(tài)。同時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行P75免疫細(xì)胞化學(xué)染色，并計(jì)算細(xì)胞純度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)純化培養(yǎng)2-8天后，P75陽(yáng)性達(dá)到90％以上。第8天后細(xì)胞純度隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而顯著下降，培養(yǎng)至25天時(shí)P75染色陽(yáng)性細(xì)胞率降至43％，而在未進(jìn)行純化培養(yǎng)的對(duì)照組，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，hOECs迅速被其它細(xì)胞污染，而且P75染色陽(yáng)性細(xì)胞所占比例較低。8天后，hOECs的比例降至18％。 結(jié)論：本培養(yǎng)純化hOECs的方法是一種較為有效、穩(wěn)定而且可靠的方法，為