分泌蛋白ZBED3與2型糖尿病的初步關(guān)系.pdf

1、第一部分、人ZBED3基因真核表達載體的構(gòu)建及鑒定
　　目的:構(gòu)建人ZBED3基因真核表達載體（pIRES2-EGFP-ZBED3），為下一步實驗打下堅實的基礎(chǔ)。
　　方法:本實驗運用RT-PCR的方法從入骨骼肌組織中獲取ZBED3cDNA片段，經(jīng)雙酶切并連接重組至真核表達載體pIRES2-EGFP，構(gòu)建pIRES2-EGFP-ZBED3的重組質(zhì)粒。而后，經(jīng)酶切及DNA測序鑒定pIRES2-EGFP-ZBED3重組質(zhì)粒鑒定以

2、保證后續(xù)實驗的有效進行。
　　結(jié)果:將雙酶切后的pIRES2-EGFP-ZBED3重組質(zhì)粒和未經(jīng)過酶切處理的重組質(zhì)粒一起，采用瓊脂糖凝膠電泳的方法進行鑒定，前者出現(xiàn)長度為687bp的ZBED3 cDNA產(chǎn)物和5.3kb左右的pIRES2-EGFP線性化質(zhì)粒兩條帶，后者則出現(xiàn)長度為5.98kb左右的pIRES2-EGFP-ZBED3重組質(zhì)粒的條帶，經(jīng)過初步鑒定，認為pIRES2-EGFP-ZBED3重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。測序結(jié)果經(jīng)DNA

3、ssist對比分析之后進一步證實所克隆的基因為人ZBED3 cDNA。
　　結(jié)論:本實驗成功構(gòu)建了人真核表達載體pIRES2-EGFP-ZBED3，可為接下來證明ZBED3鋅指蛋白是分泌蛋白奠定堅實的基礎(chǔ)。
　　第二部分、分泌蛋白ZBED3的驗證
　　目的:通過細胞水平的實驗驗證ZBED3是分泌蛋白，為探討ZBED3在生物體正常及疾患時血漿及組織分布奠定實驗基礎(chǔ)。
　　方法:培養(yǎng)HEK293T細胞，在細胞生長狀態(tài)

4、良好時收集細胞并提取細胞蛋白;利用低溫冷凍干燥抽吸技術(shù)去除培養(yǎng)液中的水分，適度濃縮細胞培養(yǎng)液并提取蛋白。分成陰性對照組、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組三組進行實驗，western blot測定三組HEK293T細胞以及其細胞培養(yǎng)液中的ZBED3蛋白的表達。
　　結(jié)果:陰性對照組、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組三組的HEK293T細胞及細胞培養(yǎng)液均觀察到ZBED3蛋白的特異性表達，且是目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組高于空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和陰性對照組。<

5、br>　　結(jié)論:ZBED3鋅指蛋白是分泌蛋白。
　　第三部分、ZBED3與2型糖尿病的初步關(guān)系
　　目的:探討ZBED3與2型糖尿病的初步關(guān)系。
　　方法:利用RT-qPCR的方法觀察小鼠多處組織ZBED3 mRNA相對表達量;培養(yǎng)正常小鼠和db/db小鼠肝臟組織塊，用不同濃度葡萄糖、胰島素、利拉魯肽刺激后，采用western blot技術(shù)測定其ZBED3蛋白表達差異;運用RT-qPCR和western blot方法觀

6、察NGT組和T2DM組ZBED3表達差異。
　　結(jié)果:ZBED3 mRNA在小鼠多處組織中均有不同程度的表達，以肌肉、脾、腎的相對表達量最高;db/db小鼠肝臟組織塊ZBED3蛋白表達明顯高于正常小鼠(P＜0.05)，采用胰島素、利拉魯肽刺激后的結(jié)果與前述一致（前者P＜0.01，后者P＜0.05）;利用四種不同濃度的葡萄糖進行干預(yù)后，經(jīng)10nmol/L濃度的葡萄糖刺激后，db/db小鼠肝組織ZBED3蛋白表達升高最明顯（P＜0.0

7、1），5nmol/L濃度的葡萄糖刺激后db/db小鼠肝組織ZBED3蛋白表達變化最小;T2DM組骨骼肌、脂肪組織中ZBED3表達明顯高于NGT組（P＜0.01）。
　　結(jié)論:胰島素和利拉魯肽能刺激ZBED3的分泌和釋放，ZBED3的表達呈現(xiàn)出明顯的胰島素濃度依賴性，ZBED3可能是胰島素信號通路下游的一個重要因子;ZBED3的釋放在某一濃度的葡萄糖刺激下達到最高，之后隨著葡萄糖濃度的增加，ZBED3的分泌和釋放不再增加，其作用達到