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1、本課題選擇傳統(tǒng)中藥蔓荊子及其原植物單葉蔓荊為研究對(duì)象,緊密圍繞蔓荊子種質(zhì)資源和抗PMS作用機(jī)制研究的需要,主要涵蓋以下兩個(gè)方面內(nèi)容。 首先采用高效液相色譜法,對(duì)蔓荊子藥材的化學(xué)指紋圖譜進(jìn)行研究,結(jié)合含量測(cè)定,發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)蔓荊子呈現(xiàn)出豐富的化學(xué)多樣性,可將不同產(chǎn)區(qū)的國(guó)產(chǎn)蔓荊子分四型。鑒于遺傳多樣性是生物多樣性(包括化學(xué)多樣性)的基礎(chǔ),通過分子生物學(xué)方法研究了不同居群間和居群內(nèi)的遺傳多樣性與空間結(jié)構(gòu),用ISSR分子標(biāo)記對(duì)不同居群的單
2、葉蔓荊進(jìn)行了遺傳多樣性和克隆變異分析。選取了沿海分布的14個(gè)不同居群的蔓荊進(jìn)行遺傳多樣性研究,發(fā)現(xiàn)其總體的變異程度不大(GD=0.190),約有60%的變異分布在居群之間,并且從 AMOVA 分析和 UPGMA 聚類分析都顯示了蔓荊不同居群間出現(xiàn)的分化;并得出蔓荊居群克隆結(jié)構(gòu)的斑塊大小約為20m,確定了在大于20m的間距內(nèi)采樣的采樣策略。從蔓荊化學(xué)多樣性與遺傳多樣性相關(guān)性的研究中,發(fā)現(xiàn)蔓荊不同居群遺傳多樣性與化學(xué)多樣性的聚類結(jié)果相當(dāng)匹配
3、,這個(gè)研究結(jié)果強(qiáng)烈地證明了在影響蔓荊化學(xué)多樣性的眾多因素中,遺傳背景不同所造成的影響有著不可忽視的作用。結(jié)合化學(xué)多樣性和遺傳多樣性更可以針對(duì)蔓荊不同化學(xué)成分進(jìn)行化學(xué)型的選擇,實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制,建立GAP基地,實(shí)現(xiàn)蔓荊有效利用、開發(fā)和保護(hù)。 同時(shí)本課題還進(jìn)行了蔓荊子活性物質(zhì)抗PMS作用機(jī)制的研究,實(shí)驗(yàn)采用泌乳素相關(guān)的整體高泌乳素模型和雌孕激素相關(guān)的現(xiàn)代細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)蔓荊子以黃酮類和萜類成分中的紫花牡荊素、木犀草素、蔓荊呋喃、
4、紫花牡荊苷為主要活性化合物,蔓荊子活性物質(zhì)群發(fā)揮抗 PMS 作用可以通過的兩條途徑起效。第一條一通過黃酮及其主要成份紫花牡荊素(又名蔓荊子黃素casticin)作用于泌乳素途徑,緩解與泌乳素升高相關(guān)的乳脹、乳痛、胸悶、頭痛等癥狀;第二條通過紫花牡荊苷和蔓荊呋喃等萜類成分調(diào)節(jié)雌孕激素的水平,從根本上緩解 PMS 由于雌激素和孕激素平衡失調(diào),雌激素 E<,2>、孕激素 P 分泌期分泌峰缺失為特征的復(fù)雜癥狀。以上研究不但說明蔓荊子通過多成分,
5、多靶點(diǎn)整合發(fā)揮抗PMS的作用的部分機(jī)制,為防治經(jīng)前期綜合征新藥臨床應(yīng)用提供很好的化學(xué)和藥理學(xué)基礎(chǔ),同時(shí)也為中藥治療具有針對(duì)多個(gè)因素、采用多個(gè)活性成分、具有多個(gè)靶點(diǎn)、進(jìn)行多個(gè)環(huán)節(jié)整體治療的特征作出有益的探索。 蔓荊子為馬鞭草科植物單葉蔓荊或三葉蔓荊的干燥成熟果實(shí),具有疏風(fēng)散熱、清利頭目的功效,臨床上主要以其治療以頭痛為主的多種痛癥,現(xiàn)代研究表明其具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎、降壓、抗氧化等作用。目前,國(guó)外已將單葉蔓荊的同屬植物穗花牡
6、荊用于防治經(jīng)前期綜合征(PMS)效果顯著。穗花牡荊我國(guó)不產(chǎn),而單葉蔓荊主產(chǎn)我國(guó),且資源豐富,與穗花牡荊有一定化學(xué)相似性,紫花牡荊素等有效成分含量高于穗花牡荊,發(fā)現(xiàn)蔓荊子具有抗PMS的新活性。本課題緊密圍繞蔓荊子種質(zhì)資源和抗PMS作用機(jī)制研究的需要,主要涵蓋以下兩個(gè)方面內(nèi)容: 第一部分,蔓荊化學(xué)多樣性與遺傳多樣性 現(xiàn)行中國(guó)藥典將單葉蔓荊和三葉蔓荊俱行收錄作為藥材蔓荊子植物來源,但就本草考證市場(chǎng)流通和臨床應(yīng)用的情況來看,仍以
7、單葉蔓荊為主,其中山東和江西為我國(guó)單葉蔓荊主產(chǎn)區(qū),以往野生資源量較大,但目前蔓荊子原意受到嚴(yán)重的破壞。蔓荊子成分多樣,藥效廣泛,而其來源單葉蔓荊分布較廣,均可能使得物種化學(xué)成分、藥效和遺傳等均呈現(xiàn)出多樣性,而這些多樣性直接關(guān)系到中藥材的質(zhì)量?jī)?yōu)劣。 本次研究首次采用單葉蔓荊 14 個(gè)沿海分布的不同居群進(jìn)行研究,在闡明其遺傳多樣性和化學(xué)多樣性的基礎(chǔ)上,研究單葉蔓荊種內(nèi)變異傳多樣性與蔓荊子化學(xué)成分多樣性的關(guān)系,尋求影響其質(zhì)量的決定因子
8、,選擇穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)的類群,保證臨床用藥的安全有效,從源頭上促進(jìn)中藥資源的開發(fā)利用和現(xiàn)代中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展。 在化學(xué)多樣性的研究中,采用HPLC法完成了14個(gè)不同居群的蔓荊子化學(xué)指紋圖譜的測(cè)定和蔓荊子主要成份紫花牡荊素的含量測(cè)定,其指紋圖譜顯示其化學(xué)成分出現(xiàn)了較大的變異。結(jié)合HPLC顯示的化學(xué)多樣性和各居群蔓荊子主成分紫花牡荊素的含量變化的差異(0.207-2.174 mg/mL) 可以將這14個(gè)不同居群的蔓荊子分為四個(gè)化學(xué)型:化學(xué)型Ⅰ紫
9、花牡荊素型;化學(xué)型Ⅱ是蔓荊子蒿素型;化學(xué)型Ⅲ是以富含低極性化合物型;化學(xué)型Ⅳ是富含高極性化合物型。指紋圖譜UPGMA 聚類圖可以看出,在化學(xué)距離參數(shù)為0.655時(shí),化學(xué)聚類也明顯的將14個(gè)居群的蔓荊子分為四組,與基于化學(xué)多樣性HPLC指紋圖譜12個(gè)特征峰人為劃分的的四個(gè)化學(xué)型完全一致。在遺傳多樣性研究中,首次用ISSR分子標(biāo)記對(duì)不同居群的單葉蔓荊進(jìn)行了遺傳多樣性和克隆變異分析。選取了沿海分布的 14個(gè)不同居群的蔓荊進(jìn)行遺傳多樣性研究,發(fā)
10、現(xiàn)其總體的變異程度不大(GD=0.190),約有60%的變異分布在居群之間,并且從 AMOVA 分析和UPGMA聚類分析都顯示了蔓荊不同居群間出現(xiàn)的分化。蔓荊的這種遺傳結(jié)構(gòu)特征除了可能與其有性與無性兩種繁殖能力有關(guān)外,也與不同居群間基因流動(dòng)受限制有關(guān)。與此同時(shí),選取了江西省新建(XJ)一個(gè)自然居群內(nèi)的135個(gè)蔓荊個(gè)體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),與一般具有克隆生長(zhǎng)習(xí)性的植物相比,蔓荊有很高的克隆多樣性(D=0.992),顯示了其很強(qiáng)的有性繁殖能力。通過
11、空間自相關(guān)分析,得出該居群克隆結(jié)構(gòu)的斑塊大小約為 20m,該研究提示在大于20m的間距內(nèi)采樣,可以避免在同一居群內(nèi)采到具有同一基因型的相似個(gè)體;同時(shí)可以考慮對(duì)遺傳多樣性豐富的居群進(jìn)行保護(hù)與利用以期培育具有優(yōu)良品質(zhì)的單葉蔓荊。 蔓荊不同居群間通過用分子生物學(xué)的手段ISSR進(jìn)行的遺傳變異研究發(fā)現(xiàn)的14個(gè)居群遺傳多樣性與化學(xué)多樣性的聚類結(jié)果相當(dāng)匹配。這個(gè)研究結(jié)果強(qiáng)烈地證明了,在影響蔓荊化學(xué)多樣性的眾多因素中,遺傳背景不同所造成的影響有
12、著不可忽視的作用。結(jié)合化學(xué)多樣性和遺傳多樣性更可以針對(duì)蔓荊不同藥效進(jìn)行化學(xué)型的選擇,實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制,保證蔓荊品質(zhì);建立GAP基地實(shí)現(xiàn)蔓荊有效利用、開發(fā)和保護(hù)。 第二部分,蔓荊子活性物質(zhì)抗PMS作用機(jī)制實(shí)驗(yàn) 采用泌乳素相關(guān)的整體高泌乳素模型和雌孕激素相關(guān)的現(xiàn)代細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),以蔓荊子黃酮類和萜類成分中的主要成份紫花牡荊素、木犀草素、蔓荊呋喃、紫花牡荊苷為主,研究蔓荊子抗PMS活性物質(zhì)的作用機(jī)制,闡明其經(jīng)不同途徑發(fā)揮抗PM
13、S的整合作用。雌孕激素相關(guān)研究一采用MCF-7細(xì)胞細(xì)胞增殖率實(shí)驗(yàn),ICI 182,780拮抗MCF-7細(xì)胞增殖作用實(shí)驗(yàn),PR、ER<,α>、ER<,β>、PS2基因mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn),MCF-7 細(xì)胞周期變化實(shí)驗(yàn),篩選蔓荊子活性物質(zhì)中對(duì)雌孕激素水平的調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)并闡明其作用的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蔓荊子總提物及其中萜類單體紫花牡荊苷和蔓荊呋喃都能顯著誘導(dǎo) MCF-7 細(xì)胞的增殖。但其中黃酮類單體紫花牡荊素和木犀草素未能表現(xiàn)促細(xì)胞增殖作用,提
14、示單體紫花牡荊苷和蔓荊呋喃具有雌激素樣作用,且紫花牡荊苷顯示更強(qiáng)的作用,其作用可以完全被ICI抑制。 細(xì)胞周期的變化可反映細(xì)胞增殖的快慢,為進(jìn)一步驗(yàn)證紫花牡荊苷和蔓荊呋喃對(duì)雌激素敏感的細(xì)胞促增殖作用,本研究采用流式細(xì)胞儀技術(shù)對(duì)MCF-7細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè),紫花牡荊苷和蔓荊呋喃都能提高M(jìn)CF-7細(xì)胞的S期細(xì)胞的百分率和細(xì)胞增殖指數(shù),且此作用能被ICI完全抑制,提示紫花牡荊苷和蔓荊呋喃確實(shí)具有促M(fèi)CF-7細(xì)胞增殖的雌激素樣作用。
15、 紫花牡荊苷和蔓荊呋喃明顯促進(jìn)MCF-7細(xì)胞ER<,β>基因mRNA的表達(dá),顯示,紫花牡荊苷和蔓荊呋喃是對(duì) ER<,β> 的選擇性高的物質(zhì)。紫花牡荊苷促。PR 基因mRNA的表達(dá)作用被ICI完全抑制,而蔓荊呋喃促PR基因mRNA的表達(dá)作用不被ICI完全抑制;同時(shí)在新藥評(píng)價(jià)中心研究也顯示了蔓荊呋喃結(jié)合孕激素受體的活性(IC<,50>=4μM),進(jìn)一步證明了蔓荊呋喃可以單獨(dú)從蛋白和基因轉(zhuǎn)錄水平直接調(diào)節(jié)孕激素的水平。 總之,蔓荊子通
16、過紫花牡荊苷和蔓荊呋喃等萜類成分,從細(xì)胞和受體水平調(diào)節(jié)雌孕激素的水平,緩解PMS由于雌激素和孕激素平衡失調(diào),雌激素E<,2>、孕激素P分泌期分泌峰缺失為特征癥狀。 泌乳素相關(guān)實(shí)驗(yàn)采用滅吐靈誘導(dǎo)的小鼠高泌乳素模型,黃酮部分及其中單體紫花牡荊素高、低劑量組都具有較強(qiáng)的降低高催乳素動(dòng)物血清泌乳素水平的作用,并且高劑量降低幅度強(qiáng)于低劑量,呈現(xiàn)量效關(guān)系趨勢(shì)。但是萜類成分及其單體沒有出現(xiàn)明顯的降低高泌乳素的作用這說明蔓荊子活性物質(zhì)群發(fā)揮抗
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