TGFβ信號通路下游分子Smad3和Smad4相互作用蛋白網(wǎng)絡研究及功能初探.pdf

1、TGF β即轉化生長因子(transforming growth factor)，是一類多功能的細胞因子，其信號途徑及相關功能也是近年來的研究熱點。以往的研究表明，TGF β與細胞的增殖、分化、遷移及凋亡有關；在機體中參與了從炎癥反應、組織修復到骨骼形成、胚胎發(fā)育等一系列重要的生物學過程；并與某些人類疾病的發(fā)生密切相關。特別是在肝臟中，該信號通路的異常與肝炎、肝纖維化、肝硬化以及肝癌都有密切關系。因此對于該通路的研究具有十分重要的生物學

2、意義；而對其各組分相互作用蛋白的研究將是闡明其功能及調控機制的關鍵所在。 本文采用高通量規(guī)模化的蛋白質相互作用研究方法Y2H技術，以TGFβ信號通路中的重要分子Smad2、3、4為誘餌，在正常成人肝臟cDNA文庫中進行相互作用蛋白的篩選。二個誘餌分子的篩選中，共獲得125個陽性克隆。經(jīng)過測序比對，排除非編碼序列及不符合閱讀框的序列后，得到二個誘餌的87個正確獵物克隆，匹配上32個基因共包含34個相互作用對。經(jīng)文獻調研，其中6對為

3、已知的相互作用，剩余28對即為本研究新發(fā)現(xiàn)的相互作用。 酵母回轉驗證中97％(33/34)的相互作用仍表現(xiàn)為陽性；隨機選取10對相互作用進行CO-IP，陽性率達到了100％，表明相互作用的可信度較高。采用生物信息學的方法，結合基因敲除信息對得到的相互作用進行了生物學相關性分析。結果顯示：66％的相互作用中獵物和誘餌具有相同的基因敲除表型；26％的獵物和誘餌具有基因共表達特性；26％的相互作用蛋白共享到GO中第六級功能注釋；56％

4、的相互作用從網(wǎng)絡拓撲結構學分析具有較高的可信度。最后整合相關參數(shù)的評分結果，對每一對相互作用給出總體評分：53％(18/34)的相瓦作用具有高可信度。 最后，將得到的相互作用以及整合了已知相互作用的數(shù)據(jù)進行可視化分析，構建相互作里網(wǎng)絡圖，對篩選結果進行補充和拓展。結合報告基因實驗結果，我們推測篩選到的Smads相互作用蛋白在TGFβ信號通路中可能具有重要的調控作用。USP7：去泛素化酶，調控Smads蛋白在細胞中的表達水平；PP

5、P1R12C：一種新的Smads蛋白去磷酸化途徑，參與TGFβ信號的活性調節(jié)；SQSTM1:作為支架蛋白通過介導Smads與其它蛋白的相互作用發(fā)揮對該信號通路的調控作用；此外本文篩選到Smad4與NLK的相互作用，這提示W(wǎng)nffTGFβ信號通路可能具有新的交互聯(lián)絡方式。另外，本文對Smad3復合體的研究進行了初步探索，擬采用串聯(lián)親和純化的方法在肝臟相關細胞系中分離純化Smad3復合體進行質譜鑒定。首先構建了靶基因的逆轉錄病毒載體，轉染包