CASE經(jīng)由MAPK通路在轉(zhuǎn)染Smad3 WT,Smad3 3S-A及Smad3 EPSM的HepG2細(xì)胞中發(fā)揮抑制細(xì)胞遷移作用.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC），因其起病隱匿，潛伏期長(zhǎng)，惡性度高，生存期短，生存質(zhì)量差，且治療棘手，素有“癌中之王”之稱，所以使得開(kāi)發(fā)新的藥物從而成為防治肝細(xì)胞肝癌的重要方向，復(fù)方芪參提取物（Compound Astragalus and Salvia miltiorrhiza extract，CASE）是由黃芪多糖、黃芪總苷、丹酚酸以最佳配比組合而成的復(fù)方制劑。
　　轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Tr

2、ansforming grouth factor-β，TGF-β）信號(hào)通路被證實(shí)是與HCC聯(lián)系最為密切的信號(hào)通路之一，在腫瘤生長(zhǎng)的不同時(shí)期，發(fā)揮不同作用。TGF-β1活化Ⅰ型 TGF-β受體（TβRI），TβRI/pSmad3C遞送腫瘤抑制信號(hào)，TGF-β1活化絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)，而 MAPK/p Smad3L遞送促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展信號(hào)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

3、CASE抗肝細(xì)胞癌的作用可能與pSmad3C/3L的表達(dá)量不同有關(guān)，隨后采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法建立Sm ad3 WT（野生型Smad3基因）、Smad3 EPSM（Smad3 L區(qū)磷酸化位點(diǎn)突變）、Smad33S-A（Smad3 C末端磷酸化位點(diǎn)突變）三種質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn) HepG2細(xì)胞株并經(jīng)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染成功；進(jìn)一步證明了CASE能不同程度的影響選擇性高表達(dá)pSmad3C/3L HepG2細(xì)胞的增殖和凋亡；但CASE對(duì)選擇性上調(diào)pSmad3C/3L的He

4、pG2細(xì)胞株的劃痕影響如何，同一濃度下對(duì)各組細(xì)胞的影響程度如何，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。
　　目的
　　1.前期已經(jīng)明確CASE對(duì)選擇性上調(diào)pSmad3C/pSmad3L的HepG2細(xì)胞凋亡及增殖的影響，在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)觀察CASE對(duì)選擇性上調(diào)pSmad3C/pSmad3L的HepG2細(xì)胞遷移的影響。
　　2.為了明確CASE影響選擇性上調(diào)pSmad3C/pSmad3L的HepG2細(xì)胞遷移分子機(jī)制，繼續(xù)在選擇性高表達(dá)pSmad3

5、C/pSmad3L的HepG2細(xì)胞及荷瘤裸鼠移植瘤模型中觀察CASE對(duì)MAPK信號(hào)通路活化的影響。
　　3.明確MAPK通路活化對(duì)選擇性上調(diào)pSmad3C/pSmad3L的HepG2細(xì)胞遷移、增殖、凋亡等細(xì)胞功能的影響。
　　方法：
　　1.體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察CASE對(duì)Smad3 WT，Smad3 EPSM及Smad33S-A三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞移行能力的影響
　　經(jīng)課題組前期驗(yàn)證的穩(wěn)轉(zhuǎn)Smad3 WT，

6、Smad3 EPSM及Smad33S-A三種質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞體外培養(yǎng)，進(jìn)行劃痕損傷，加或不加CASE（20 mg/L），同時(shí)加入9 pmol/L的TGF-β1共培養(yǎng)，分別在劃痕后0，12，24 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在顯微鏡下拍照。
　　2.Western blot法檢測(cè)CASE（80 mg/L）干預(yù)下Smad3 WT，Smad3 EPSM及Smad33S-A三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞內(nèi)MAPK蛋白磷酸化情況
　　細(xì)胞培養(yǎng)，培

7、養(yǎng)結(jié)束前24 h，加或不加CASE（80 mg/L）；結(jié)束前1 h，加或不加9 pmol/L TGF-β1，采用Western-blot法，以非磷酸化JNK1/2，ERK1/2，p38為參照，檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi) pJNK1/2，pERK1/2，pp38的表達(dá)情況。
　　3. Western blot法檢測(cè)荷瘤裸鼠移植瘤模型內(nèi)MAPK蛋白磷酸化情況
　　裸鼠腋下接種三種質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞建立移植瘤模型，給予或不給予CASE（3

8、10 mg/kg/d），Western-blot法檢測(cè)移植瘤中pJNK1/2，pERK1/2，pp38蛋白水平，以非磷酸化JNK1/2，ERK1/2，pp38為參照。
　　4.體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察 ERK抑制因子 PD98059（10umol/L），JNK抑制因子SP600125（10umol/L）和P38抑制因子SB203580（10umol/L）對(duì)Smad3 WT，Smad3 EPSM及Smad33S-A三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG

9、2細(xì)胞移行能力的影響
　　細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行劃痕損傷，加或不加三種 MAPK抑制因子處理，同時(shí)加入9 pmol/L的TGF-β1共培養(yǎng)，分別在劃痕后0，12，24 h拍照。
　　5.MTT法檢測(cè)三種特異性MAPK抑制因子對(duì)三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞增殖能力的影響
　　細(xì)胞培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前5 h，加或不加三種MAPK抑制因子處理5 h，同時(shí)加或不加9 pmol/L的TGF-β1共培養(yǎng)，使用酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)每孔吸光度值。

10、
　　6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三種MAPK抑制因子對(duì)三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞凋亡的影響
　　細(xì)胞培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前5 h，加或不加三種MAPK抑制因子處理，結(jié)束前1h，加或不加9 pmol/L的TGF-β1共培養(yǎng)，對(duì)照組細(xì)胞加入等量溶媒，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)染Smad3 WT，Smad3 EPSM及Smad33S-A三種質(zhì)粒HepG2細(xì)胞中CASE對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移的影響
　

11、　CASE抑制TGF-β1促進(jìn)轉(zhuǎn)染Smad3 WT及Smad33S-A質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞遷移能力，而減弱細(xì)胞遷移能力（P<0.01）；CASE增強(qiáng)TGF-β1減弱轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM質(zhì)粒組細(xì)胞遷移能力，較轉(zhuǎn)染Smad3 WT或Smad33S-A質(zhì)粒組，轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞增強(qiáng)CASE對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移的抑制作用（P<0.01）。
　　2. CASE對(duì)MAPK信號(hào)通路的調(diào)控作用
　　2.

12、1 CASE對(duì)裸鼠腋下接種轉(zhuǎn)染Smad3 WT，Smad3 EPSM及Smad33S-A三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞建立的移植瘤MAPK通路的調(diào)控作用
　　結(jié)果顯示，CASE減少Smad3 EPSM組，Smad33S-A組ERK磷酸化，且較轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM質(zhì)粒組，CASE下調(diào)轉(zhuǎn)染Smad33S-A質(zhì)粒組p-ERK能力更強(qiáng)（P<0.01）。CASE均能不同程度的減少三組移植瘤中 JNK的磷酸化，且較轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM，

13、Smad3 WT質(zhì)粒組，CASE下調(diào)轉(zhuǎn)染 Smad33S-A質(zhì)粒組最明顯（P<0.01）。CASE均能不同程度上調(diào)p-p38表達(dá)，且較轉(zhuǎn)染Smad3 WT組及Smad33S-A組，CASE對(duì)轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM組上調(diào)能力更明顯（P<0.01）。
　　2.2 CASE對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染Smad3 WT，Smad3 EPSM及Smad33S-A三種質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)通路的影響
　　結(jié)果顯示，CASE抑制

14、TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM及Smad3 WT質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞p-ERK增加的作用，而使ERK磷酸化減少，且CASE對(duì)轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM質(zhì)粒組細(xì)胞下調(diào)p-ERK表達(dá)作用更明顯（P<0.01）；CASE能不同程度的使三組細(xì)胞p-JNK蛋白表達(dá)減少，且較Smad33S-A-HepG2細(xì)胞，CASE對(duì)Smad3 EPSM-HepG2細(xì)胞中 p-JNK表達(dá)下調(diào)的更明顯（P<0.01）。CASE均能不同程度上調(diào)p-p38表

15、達(dá)，且較轉(zhuǎn)染Smad3 WT質(zhì)粒組細(xì)胞，CASE對(duì)轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM，Smad33S-A質(zhì)粒組細(xì)胞上調(diào)能力更明顯（P<0.01）。
　　3.三種MAPK抑制因子(ERK抑制因子PD98059，JNK抑制因子SP600125，p38抑制因子SB203580）對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染Smad3 WT，Smad3 EPSM及Smad33S-A三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞功能的影響
　　3.1三種MAPK抑制因子對(duì)TGF-β1

16、誘導(dǎo)的三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞遷移的影響
　　細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三種 MAPK抑制因子均可不同程度的抑制 TGF-β1誘導(dǎo)的增強(qiáng)三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞遷移能力，而降低細(xì)胞遷移率，JNK抑制因子抑制細(xì)胞遷移能力最強(qiáng)（P<0.01），其中，三種MAPK抑制因子對(duì)轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM質(zhì)粒組細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)（P<0.05），對(duì)轉(zhuǎn)染Smad33S-A質(zhì)粒組細(xì)胞遷移抑制最弱（P<0.05）。
　　3.2三種MAPK抑制

17、因子對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞增殖的影響
　　MTT結(jié)果顯示，三種MAPK抑制因子均能不同程度的抑制TGF-β1誘導(dǎo)的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，而減慢細(xì)胞增殖率，JNK抑制因子抑制細(xì)胞遷移能力最強(qiáng)（P<0.01）；三種MAPK抑制因子對(duì)轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM質(zhì)粒細(xì)胞增殖抑制作用最強(qiáng)（P<0.01）。
　　3.3三種MAPK抑制因子對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞凋亡的影響
　　根據(jù)細(xì)胞凋

18、亡結(jié)果顯示，三種 MAPK抑制因子均能不同程度的促進(jìn) TGF-β1誘導(dǎo)的三種質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn) HepG2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡，ERK抑制因子促凋亡作用最明顯（P<0.01）。三種MAPK抑制因子對(duì)轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM質(zhì)粒細(xì)胞的促凋亡作用最為明顯（P<0.01），而對(duì)轉(zhuǎn)染Smad33S-A質(zhì)粒HepG2細(xì)胞促凋亡作用最弱。
　　結(jié)論：
　　CASE可能通過(guò)抑制ERK，JNK通路活化及促進(jìn)p38通路活化而不同程度降低Smad3 WT，Sm