人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7基因強化的組織工程骨的構(gòu)建及對兔骨缺損修復(fù)作用研究.pdf

1、目的：創(chuàng)傷、感染、腫瘤、先天性疾病等原因所致的骨缺損臨床常見。組織工程骨兼有骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性，且可根據(jù)需要制成不同的形狀，為臨床治療大段骨缺損帶來希望。但是組織工程研究中，細胞因子無論是從天然生物中提純，還是用基因工程表達，均存在程序復(fù)雜，產(chǎn)量低，活性不穩(wěn)定等缺點，因此如何有效發(fā)揮細胞生長因子適時、適量效用，利用細胞與基質(zhì)材料特異性黏附，細胞增殖，定向分化，發(fā)揮正常的生理功能，以實現(xiàn)最終理想的功能替代，一直是組織工程研究的難點與熱點，

2、基因工程技術(shù)與組織工程的結(jié)合為以上問題的解決提供了可供選擇的良好辦法。 目前BMP-7重組蛋白及醫(yī)用硫酸鈣已商品化。本實驗以醫(yī)用硫酸鈣為支架材料，轉(zhuǎn)染人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)基因的骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)作為種子細胞，體外構(gòu)建基因強化的組織工程骨，并研究該組織工程骨對骨缺損的治療作用。希望能為骨缺損的治療提供實驗和理論依據(jù)。 方法： 1.BMP-7基因重組腺病毒載體(Ad.BMP-7)的構(gòu)建抽提人胎腎

3、組織總mRNA，經(jīng)RT-PCR合成rBMP-7基因，繼而再將其插入帶有腺病毒基因組的、擴增后挑選插入方向正確的克隆。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下，用攜帶目的基因的粘粒載體pAxcAwt.BMP-7與腺病毒基因組末端蛋白DNA-TPC共同轉(zhuǎn)染293細胞，制備重組腺病毒。通過對重組腺病毒DNA進行PCR檢測及酶切鑒定，將鑒定好的病毒克隆進一步擴增、純化和測定滴度。 2.髓基質(zhì)細胞體外的分離、培養(yǎng)以及Ad.BMP-7體外轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細胞后的表達采用

4、密度梯度離心法與貼壁篩選法聯(lián)合體外分離、培養(yǎng)兔骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)，觀察原代及傳代細胞的生長發(fā)育情況，并繪制生長曲線。Ad.BMP-7轉(zhuǎn)染BMSCs，使用熒光顯微鏡和免疫組化方法檢測BMP-7蛋白在細胞中的表達。 3.體外構(gòu)建BMP-7基因強化的組織工程骨將第三代骨髓基質(zhì)細胞和轉(zhuǎn)染BMP-7基因的骨髓基質(zhì)細胞分別與硫酸鈣材料在體外復(fù)合培養(yǎng)，通過消化法、倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察細胞在材料上的黏附情況，繪制細胞生長曲線。

5、 4.基因強化的組織工程骨對骨缺損修復(fù)的動物實驗60只新西蘭大白兔隨機分為A、B和C三組，每組20例。A組在骨缺損處植入BMP-7基因+BMSCs+醫(yī)用硫酸鈣材料，B組在骨缺損處植入BMSCs+醫(yī)用硫酸鈣材料，C組單純植入醫(yī)用硫酸鈣。分別在術(shù)后4、8和12周取材，通過大體觀察、影像學(xué)、組織學(xué)和生物力學(xué)等方法觀察實驗動物骨缺損的修復(fù)情況。 結(jié)果： 1.提取的RNA完整，純度高。RT-PCR合成的DNA片段經(jīng)克隆、測序

6、后確證為目的基因(BMP-7基因)，插入粘粒載體pAxCAwt后獲得高滴度重組腺病毒(108pfu/ml)。 2.培養(yǎng)獲得了高純度的兔骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)。骨髓基質(zhì)細胞轉(zhuǎn)染Ad.aBMP-7后72小時熒光顯微鏡可見綠色熒光蛋白表達，細胞免疫組化結(jié)果顯示細胞內(nèi)有BMP-7蛋白的表達。 3.骨髓基質(zhì)細胞及轉(zhuǎn)染BMP-7基因的骨髓基質(zhì)細胞在硫酸鈣表面均有生長，且隨著復(fù)合培養(yǎng)時間的延長，材料上細胞的數(shù)量也隨之增長。

7、 4.影像學(xué)、病理學(xué)及生物力學(xué)檢測結(jié)果：BMP-7基因修飾的組織工程骨在植入動物骨缺損區(qū)后，能更快地修復(fù)骨缺損。 結(jié)論： 1.DNA末端蛋白復(fù)合物可使重組腺病毒的制備效率大大提高，降低野生型腺病毒出現(xiàn)的概率。重組腺病毒滴度高、純度好、毒性低。 2.我們構(gòu)建的攜帶BMP-7基因的腺病毒載體，能高效轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細胞。后者能夠表達、分泌BMP-7蛋白。 3.成功構(gòu)建BMP-7基因強化的組織工程骨。