肝硬化基礎上肝癌的臨床危險因素分析及肝癌與肝硬化微小RNA差異表達研究.pdf

1、目的：
　　1.初探新疆地區(qū)肝硬化病因特點及肝細胞性肝癌發(fā)生危險因素，以及肝硬化患者血液生化學特征。
　　2.篩選乙肝肝硬化肝癌患者肝癌組織與肝硬化組織微小RNA（microRNA，miRNAs，miRNA）差異表達譜。
　　3.檢測差異表達最明顯的miRNA在原發(fā)性肝癌（Primary Liver Cancer，PLC）患者肝癌組織中的表達。為原發(fā)性肝癌分子機制研究提供新的思路和途徑，為原發(fā)性肝癌早期診斷提供分子指標

2、的篩選奠定基礎。
　　方法：
　　1.回顧分析新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院近11年確診的7212例肝硬化住院患者病因構成，探討乙型肝炎病毒（hepatitisB virus HBV）感染合并酒精因素、乙肝病毒、丙肝病毒、飲酒、性別、年齡、種族、2型糖尿病對肝硬化人群肝細胞性肝癌發(fā)生的影響；對乙肝病毒合并酒精因素肝硬化患者與乙肝病毒不合并酒精肝硬化組、酒精性肝硬化組在年齡、性別、民族、肝硬化嚴重程度、血常規(guī)、生化指標的特征進行組間

3、比較；
　　2.在7212例肝硬化患者合并原發(fā)性肝癌的1169例患者中，選取行肝癌根治治療的9例患者，取手術切除的肝癌標本（實驗組）及距腫瘤5cm以上的肝硬化標本（對照組）。利用Trizol法提取肝癌組織和配對的肝硬化組織細胞中的總 RNA，分光光度計 NanoDropND-1000進行定量，變性凝膠電泳分析提取的總RNA質量。利用芯片技術對提取的RNA經(jīng)microRNA芯片進行雜交，結果經(jīng)掃描讀數(shù)，最后用Significance

4、 Analysis of Microarrays軟件version3.02（SAM）挑選差異表達基因。選擇篩選出的2個差異表達明顯的miRNAs hsa-miR-1269和hsa-miR-199b-3p進行實時熒光定量PCR驗證；
　　3.結果采用Rral-time PCR法，進一步測定hsa-miR-1269在肝癌組織和肝硬化組織中的表達水平。
　　結果：
　　1.7212例肝硬化病因構成前五位分別是乙型肝炎55.1

5、0％，丙型肝炎13.42%，原發(fā)性膽汁性肝硬化9.28%，酒精性6.36%，隱源性9.01%；16.5%發(fā)生肝細胞性肝癌，住院期間死亡6.3%，合并糖尿病占總體12.1%。其中3976例乙肝肝硬化患者中24.25%合并酒精因素，合并酒精因素乙肝肝硬化患者、單純乙肝肝硬化組和酒精性肝硬化患者相比，在白細胞計數(shù)、平均紅細胞體積、γ-谷氨酰轉肽酶、血清尿酸水平呈現(xiàn)出酒精性肝病特征，且均值水平高于單純乙肝肝硬化組；HBV感染、HCV感染、飲酒、

6、男性、高齡為本組肝硬化患者肝細胞性肝癌發(fā)生獨立危險因素，而民族（維吾爾族、其他民族與漢族相比）、2型糖尿病未增加本組肝硬化患者肝癌的發(fā)生。
　　2.miRNAs在肝硬化肝癌患者肝癌組織與肝硬化組織中的差異表達：實驗組和對照組差異表達的miRNAs共有15個，分別為hsa-miR-1269，hsa-miR-18a，hsa-miR-1180，hsa-miR-1301，hsa-miR-182，hsa-miR-222，hsa-miR-36

7、2-5p，hsa-miR-99a，hsa-miR-10a，hsa-miR-30a，hsa-miR-30e，hsa-miR-139-5p，hsa-miR-422a，hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-199b-3p。實時熒光定量PCR驗證結果：hsa-miR-1269在實驗組和對照組中的平均表達豐度分別為12.058±3.954和16.678±2.352，差異具有統(tǒng)計學意義（p=0.008）。hsa-miR-199b-3p在實

8、驗組和對照組中的平均表達豐度分別為5.417±1.633和3.033±0.768，差異具有統(tǒng)計學意義（p=0.001）。hsa-miR-1269在肝癌組織中表達上調(diào)，hsa-miR-199b-3p在肝癌組織中表達下調(diào)，與miRNAs微陣列芯片結果一致。
　　3.hsa-miR-1269在肝硬化肝癌患者肝癌組織和肝硬化中的表達：實時熒光定量PCR結果：hsa-miR-1269在實驗組和對照組中的平均表達豐度分別為12.634±4.0

9、04和16.963±1.832，差異具有統(tǒng)計學意義（p=0.001）。
　　結論：
　　1.新疆地區(qū)乙型肝炎病毒感染是該地區(qū)肝硬化主要原因，但酒精因素與 HBV重疊較普遍是其特征；HBV合并酒精因素肝硬化組較乙肝肝硬化組面臨更高的氧化應激壓力，間接提示酒精因素的參與可能增加乙肝感染者發(fā)生肝硬化的機會；HBV感染、HCV感染、酒精（包括飲酒史不詳者）、男性、高齡為該組肝硬化患者HCC獨立危險因素。民族及2型糖尿病并未增加肝硬化

10、患者肝細胞肝癌的發(fā)生；
　　2.在乙肝肝硬化肝癌患者肝癌組織與肝硬化組織中篩選出了15種差異表達的miRNAs，其中 hsa-miR-1180，hsa-miR-1301在國內(nèi)外文獻中未見報道，而hsa-miR-1269和hsa-miR-10a與其他一些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關，但未見在肝癌中的報道；
　　3.在15種差異表達的miRNAs中，hsa-miR-1269在肝硬化肝癌患者肝癌組織中呈明顯的高表達，是一種功能上類似促癌基