大鼠準(zhǔn)分子激光術(shù)后角膜上皮下霧狀混濁中Ⅰ型前膠原的測(cè)定.pdf

1、目的：探討準(zhǔn)分子激光手術(shù)后大鼠角膜的Ⅰ型前膠原變化情況,比較角膜非手術(shù)區(qū)、手術(shù)野透明區(qū)與 haze區(qū)的Ⅰ型前膠原含量的差異,并做出時(shí)間含量曲線,對(duì) haze區(qū)的面積和程度與前膠原的含量做相關(guān)分析,為進(jìn)一步研究其分泌、外環(huán)境及加工的酶含量和活性變化提供有力的理論支持。
　　方法：首先建立大鼠PRK手術(shù)模型,術(shù)后每日用裂隙燈顯微鏡觀察大鼠角膜haze的形成,并以Seiler[1]5級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)。于術(shù)前、術(shù)后第1天、3天、7天、15天

2、、1月、2月、3月處死大鼠,取出眼球并立即在裂隙燈顯微鏡下用針刺標(biāo)記出haze的范圍,隨即O將角膜取出,固定于標(biāo)本保存液中。用HE染色法對(duì)膠原進(jìn)行染色并在光鏡下觀察膠原結(jié)構(gòu)形態(tài)。用鼠抗羊Ⅰ型前膠原的抗體結(jié)合SABC法檢測(cè)與定位角膜Ⅰ型前膠原,光鏡下觀察其分布及量的變化,并用圖像分析軟件于不同的時(shí)間采集角膜非手術(shù)區(qū)、手術(shù)野透明區(qū)與 haze區(qū)中Ⅰ型前膠原染色的光密度值,利用平均光密度值對(duì)它們之間Ⅰ型前膠原含量進(jìn)行定量分析。
　　結(jié)果

3、：我們觀察到角膜的haze于術(shù)后15天開始出現(xiàn),于術(shù)后2個(gè)月其分級(jí)達(dá)到最高,其分級(jí)與Ⅰ型前膠原含量有明顯的相關(guān)性(r=0.406,p<0.05),此后減弱有所消退,但不隨Ⅰ型前膠原的含量下降而下降(r=0.231,p>0.05);HE染色顯示手術(shù)后15天角膜細(xì)胞發(fā)生明顯的變化,出現(xiàn)了空泡,角膜基質(zhì)的膠原纖維排列紊亂,極不規(guī)則,于 haze標(biāo)記處更為明顯。用鼠抗羊Ⅰ型前膠原的抗體結(jié)合SABC法檢測(cè)與定位角膜Ⅰ型前膠原,光鏡下表現(xiàn)為Ⅰ型前膠

4、原主要出現(xiàn)于細(xì)胞外基質(zhì)中,細(xì)胞內(nèi)未檢測(cè)到明顯的分布,正常角膜與手術(shù)區(qū)角膜中均有分布,但正常角膜中含量恒定,隨時(shí)間延長(zhǎng)其顏色逐步加深,特別在 haze區(qū),其染色與周圍有明顯的差異。用圖像分析軟件檢測(cè)角膜Ⅰ型前膠原的光密度值表明,非手術(shù)區(qū)角膜平均光密度值各時(shí)間段內(nèi)的Ⅰ型前膠原的含量均無(wú)明顯變化(p>0.05);手術(shù)區(qū)角膜中的Ⅰ型前膠原含量于術(shù)后第三天開始顯著增加(p<0.05),隨時(shí)間延長(zhǎng)而含量逐步升高,于手術(shù)后兩個(gè)月達(dá)到最高峰,3個(gè)月時(shí)Ⅰ

5、型前膠原的含量明顯下降但仍高于手術(shù)前及術(shù)后第一天(p<0.05)。術(shù)后第15天、1月、2月、3月,haze區(qū)Ⅰ型前膠原的含量明顯高于非haze區(qū)(p<0.05),手術(shù)區(qū)較非手術(shù)區(qū)Ⅰ型前膠原的含量顯著增多說(shuō)明Ⅰ型前膠原參與了角膜的損傷修復(fù)過(guò)程,其含量隨修復(fù)的進(jìn)行而不斷增加,在修復(fù)完成后,其含量開始下降;在haze區(qū)較非haze的顯著增加且與haze形成程度有明顯相關(guān)性表明,Ⅰ型前膠原的異常增多是 haze形成的重要原因,可能是導(dǎo)致的角膜膠