白藜蘆醇對(duì)組織工程化軟骨的保護(hù)作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的:
　　骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種退行性關(guān)節(jié)疾病,是目前威脅著老齡人口健康的主要問題之一。盡管創(chuàng)傷是引起軟骨細(xì)胞損傷,導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的最重要的因素,遺傳基因也在OA的過程中扮演著重要的角色。最近的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示軟骨細(xì)胞在基因水平的表達(dá)改變是引起OA的一個(gè)重要因素,其中沉默信息調(diào)節(jié)因子SIRT1是目前研究的一大熱點(diǎn)。SIRT1在生物體細(xì)胞中是調(diào)控其增殖分化、炎癥、應(yīng)激的一個(gè)重要蛋白,并與多種老齡疾病相關(guān)聯(lián),如II型糖尿病,老年癡呆

2、和骨質(zhì)疏松等。實(shí)驗(yàn)研究表明,OA軟骨細(xì)胞內(nèi)的SIRT1的水平與軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)(EMC)和細(xì)胞在炎癥中存活密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察SIRT1表達(dá)在炎癥環(huán)境中的調(diào)控改變,研究白藜蘆醇對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組織工程化軟骨的保護(hù)作用并進(jìn)一步探討其相關(guān)保護(hù)機(jī)制。
　　材料與方法:
　　本實(shí)驗(yàn)首先將體外單層擴(kuò)增的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在藻酸鈉微球中行三維立體軟骨細(xì)胞定向培養(yǎng),其定向分化程度通過甲苯胺藍(lán)染色,免疫組織化學(xué)等方法鑒定。然后將

3、從微球釋放的分化軟骨細(xì)胞接種于殼聚糖-明膠復(fù)合支架,培養(yǎng)3周后制備組織工程化軟骨,其內(nèi)部軟骨細(xì)胞以及支架形態(tài)用掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察。將白細(xì)胞介素(IL)-1β作用于該細(xì)胞-支架材料上,并用白藜蘆醇和(或)特異性的抗整合素β1亞單位抗體進(jìn)一步干預(yù),蛋白印跡法檢測(cè)II型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13以及核因子-κB的表達(dá),掃描蛋白印跡條帶灰度并進(jìn)行半定量計(jì)算,采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　結(jié)果:
　　在定向培

4、養(yǎng)過程中,藻酸鹽微球中的軟骨細(xì)胞在細(xì)胞周圍可形成明顯的細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)分化,軟骨細(xì)胞特異性II型膠原和蛋白聚糖表達(dá)顯著增高。定向分化后的軟骨細(xì)胞在殼聚糖-明膠復(fù)合支架材料上能良好的貼壁、增殖和遷徙,形成組織工程化的軟骨。蛋白印跡半定量分析:軟骨II型膠原對(duì)照組表達(dá)量0.484±0.006;白藜蘆醇干預(yù)后表達(dá)量0.474±0.014,兩者無明顯差別(P>0.05);IL-1β干預(yù)后,表達(dá)量下降至0.155±0.009,統(tǒng)計(jì)差異顯著(P<0

5、.05);而白藜蘆醇能阻斷IL-1β的負(fù)面效應(yīng),使II型膠原表達(dá)量恢復(fù)至0.468±0.014,統(tǒng)計(jì)差異明顯(P<0.05),同對(duì)照組無明顯差異(P>0.05);而抗β1整合素能阻斷白藜蘆醇對(duì)IL-1β的拮抗作用,使膠原表達(dá)量下降至0.169±0.011,差異顯著(P<0.05),較之IL-1β單獨(dú)作用無明顯差別(P>0.05)。蛋白聚糖半定量統(tǒng)計(jì)和II型膠原的表達(dá)趨勢(shì)相同,同時(shí)伴隨MMP-13、核因子—κB的反向表達(dá)。結(jié)果顯示:白藜蘆