不同分子質量海帶苔藻聚糖硫酸酯抗血栓活性及機理研究.pdf

1、巖藻聚糖硫酸酯是一種富含硫酸基團的陰離子多糖,主要來源于褐藻、海參和海膽等。因其具有抗凝血、抗病毒、抗腫瘤、抑制血管增殖以及抗氧化等多種生物學活性,成為當今海洋功能性食品和藥物研究的熱點。
　　體外研究表明,不同來源的大分子巖藻聚糖硫酸酯均具有良好的抗血栓活性。但由于這些大分子巖藻聚糖硫酸酯一般分子組成復雜,溶解性低,吸收較差。若直接注射又會產生較大的毒性,進入體內后副作用較大,限制了其應用。
　　近年來,有報道稱從泡葉藻中

2、提取的低分子質量巖藻聚糖硫酸酯在體內同樣顯示出抗血栓活性。由于提取來源不同,巖藻聚糖硫酸酯的化學組分和結構會有較大差異,對于從海帶中提取的低分子質量的巖藻聚糖硫酸酯是否同樣具有抗血栓活性,還鮮有報道,亦未見對其抗血栓機制進行研究的相關報道。
　　本課題組前期應用自由基氧化法和陰離子交換法,從海帶中制備純化了具有不同分子質量和硫酸根含量的4種巖藻聚糖硫酸酯組分,分別為低分子質量的巖藻聚糖硫酸酯LF1和LF2,中分子質量的MFa和MF

3、b。本文對這4種巖藻聚糖硫酸酯進行了抗血栓活性以及相關機理的研究,主要工作及結論如下:
　　1.對不同分子質量海帶巖藻聚糖硫酸酯的體內抗血栓活性進行了研究
　　首先對不同分子質量海帶巖藻聚糖硫酸酯進行急性毒性研究,并結合前期預實驗得到的藥效學結果,確定合理的給藥劑量。在此基礎上,采用Fecl3刺激法制作動脈血栓模型,采用結扎法制作下腔靜脈血栓模型,對不同分子質量和硫酸根含量的巖藻聚糖硫酸酯體內抗血栓活性進行全面評價。

4、　　通過急性毒性實驗發(fā)現(xiàn),隨著分子質量的增加,其毒性逐漸增強。其中2種LMWF的LD50相近(分別為716.0mg·kg-1和639.1 mg·kg-1),而2種MMWF的LD50相近(分別為50.6 mg·kg-1和45.1 mg·kg-1)。
　　在本實驗中,4種巖藻聚糖硫酸酯均具有良好的抗血栓作用。且隨著分子質量增加,其血栓濕重逐漸減少,血栓生成抑制率逐漸增加,說明其抗血栓作用逐漸增強。并且這種抗血栓活性呈現(xiàn)明顯的劑量相關性

5、。
　　2.對不同分子質量海帶巖藻聚糖硫酸酯的內皮保護作用及其機制進行了研究。
　　同時采用體內研究和體外研究的方法,探討了不同分子質量海帶巖藻聚糖硫酸酯對內皮細胞的保護作用。在體內研究中,通過制作大鼠內皮損傷模型,顯微鏡下觀察大鼠胸主動脈內皮損傷情況,并測定內皮損傷指標血管性血友病因子(vWF)。在體外研究中,通過細胞培養(yǎng),考察藥物對內皮損傷的保護作用,除vWF外,本文還使用內皮微顆粒(EMPs)水平作為內皮損傷指標。

6、r>　　在本文中,我們發(fā)現(xiàn)低分子質量的巖藻聚糖硫酸酯對內皮細胞均具有良好的保護作用;而中分子質量的巖藻聚糖硫酸酯雖然對內皮細胞的損傷有所改善,但這種保護作用遠遠低于LMWF。同時發(fā)現(xiàn),LMWF可通過降低vWF和EMPs濃度,阻斷血小板與受損血管內皮中的膠原結合,從而抑制了血小板活化,發(fā)揮內皮保護作用。
　　3.考察了不同分子質量海帶巖藻聚糖硫酸酯對血小板系統(tǒng)的影響及其作用機制
　　通過制作大鼠血管內皮損傷模型,考察了海帶巖藻

7、聚糖硫酸酯對血小板粘附率的影響;應用二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)和血小板活化因子(PAF)3種誘導劑考察了海帶巖藻聚糖硫酸酯對血小板聚集率的影響;檢測了影響血小板聚集的重要指標TXB2和6-Keto-PGF1α和對胞漿Ca2+內流的影響。
　　結果顯示,低分子質量的LF1和LF2均可明顯降低血小板粘附率,而中分子質量的MFa和MFb對血小板粘附率沒有明顯影響。LF1和LF2對由ADP、AA和PAF誘導的血小板聚集均具有

8、較好的抑制作用,而中分子質量的MFa和MFb對血小板聚集不僅沒有抑制作用,反而表現(xiàn)出促進血小板聚集的作用。4組巖藻聚糖硫酸酯均表現(xiàn)出降低TXB2的作用,其中LF1和LF2組的降低作用強于MFa和MFb;另外,LF1和LF2同時具有升高6-keto-PGF1α的作用,而MFa和MFb則與模型組比較無統(tǒng)計學差異。此外,LMWF會對PAF誘導產生的Ca2+內流起到顯著的抑制作用,而MMWF則沒有這種抑制作用。
　　研究結果表明,LMWF

9、可通過抑制血小板的粘附和聚集,發(fā)揮抗血栓作用;而MMWF對血小板功能影響很小,其抗血栓作用更依賴于其他途徑。進一步發(fā)現(xiàn),LMWF抑制血小板活化的具體作用機制是通過降低TXB2和升高6-Keto-PGF1α水平,以及抑制胞外Ca2+內流來實現(xiàn)的。
　　4.對不同分子質量海帶巖藻聚糖硫酸酯的抗凝活性和相關機制進行了研究以抗血栓活性實驗中確定的巖藻聚糖硫酸酯劑量為基礎,通過體內研究,首先對不同分子質量巖藻聚糖硫酸酯的抗凝血活性進行了比較

10、。并通過出血實驗,考察了不同分子質量的海帶巖藻聚糖硫酸酯作為抗栓候選藥的安全性。最后,通過對調節(jié)凝血過程的幾種關鍵物質TFPI、AT-Ⅲ、PC和FIB進行檢測,對其抗凝血機理進行了深入探討。
　　結果顯示,海帶巖藻聚糖硫酸酯的抗凝活性呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性,并且抗凝活性隨著分子質量的增加而增加。此外,出血實驗顯示,隨著海帶巖藻聚糖硫酸酯的分子質量增加,出血危險性也增加。
　　研究結果表明,不同分子質量的巖藻聚糖硫酸酯,發(fā)揮抗凝

11、作用的機制也不同。對于LMWF而言,主要通過提高TFPI活性發(fā)揮作用;而MMWF除可通過TFPI途徑發(fā)揮抗凝作用外,當達到一定濃度時,會通過影響纖維蛋白原濃度發(fā)揮抗凝血作用。
　　5.考察了不同分子質量海帶巖藻聚糖硫酸酯對纖溶系統(tǒng)的影響及其作用機制首先通過體內研究,考察巖藻聚糖硫酸酯對全血凝塊溶解實驗、優(yōu)球蛋白溶解時間兩個纖溶指標,對不同分子質量的海帶巖藻聚糖硫酸酯纖溶活性進行了比較。并通過大鼠動脈血栓模型和靜脈血栓模型,考察了調

12、節(jié)體內纖溶系統(tǒng)的關鍵指標尿激酶型纖溶酶原活化劑(u-PA)、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)、纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)等,以確定具體的作用機理。
　　結果顯示,海帶巖藻聚糖硫酸酯的纖溶活性隨著分子質量的增加而逐漸增強。同時,纖溶活性的強弱也呈現(xiàn)出一定的劑量相關性。說明對巖藻聚糖硫酸酯可通過激活纖溶酶原轉換為纖溶酶發(fā)揮溶栓作用。從結果中還可以看出,其對纖溶酶原的激活主要是通過增強t-PA活性和抑制PAI-1活性來實現(xiàn)的

13、。對u-PA活性并無影響。
　　6.考察了不同分子質量海帶巖藻聚糖硫酸酯對血液流變學的影響
　　通過制作大鼠血瘀模型,考察了巖藻聚糖硫酸酯對全血黏度、血漿黏度、紅細胞壓積、紅細胞沉降率等血液流變學參數(shù)的影響。
　　結果顯示,LMWF對各項血液流變學指標均沒有改變,而MMWF可明顯降低全血黏度、血漿黏度、紅細胞壓積、紅細胞沉降率及血沉方程K值等指標,提示通過改善血液流變學指標,可能是MMWF發(fā)揮抗血栓作用的一個重要途徑。

14、
　　通過本文的研究,我們證實了海帶中提取的不同分子質量的巖藻聚糖硫酸酯同時具有抗凝血和溶栓的功能,還可通過抑制血小板活化而發(fā)揮良好的內皮保護作用,這是目前臨床所使用的抗血栓藥所不具備的,因此具有良好的開發(fā)前景。
　　另外我們也發(fā)現(xiàn),海帶巖藻聚糖硫酸酯發(fā)揮抗血栓作用的的途徑隨著分子質量的不同會發(fā)生改變,對于低分子質量的海帶巖藻聚糖硫酸酯主要是通過抗凝血、抗血小板活化和纖溶功能發(fā)揮抗血栓作用;而對于中分子質量海帶巖藻聚糖硫酸酯

15、來說,主要通過抗凝血、纖溶作用和改善血液流變學來發(fā)揮抗血栓作用。
　　通過本文的研究發(fā)現(xiàn),對于同一種生物功能,其作用強弱甚至是作用機制也會隨著分子質量的改變而發(fā)生改變。如LMWF與MMWF均具有抗凝血和纖溶作用,但這兩種作用都隨著海帶巖藻聚糖硫酸酯分子質量的增加而增強。同時,雖然不同分子質量巖藻聚糖硫酸酯都具有抗凝血功能,但LMWF主要通過提高TFPI活性發(fā)揮作用;而MMWF除可通過TFPI途徑發(fā)揮抗凝作用外,當達到一定濃度時,會