硫酸皮膚素和硫酸乙酰肝素的制備及其抗血栓相關(guān)活性協(xié)同作用研究.pdf

1、血栓性疾病發(fā)病率逐年升高，嚴重危害人類健康，其導致的死亡和致殘在全世界都是第一位的。各種原因引起的全身或局部血流緩慢、淤滯是血栓形成的重要因素，如高纖維蛋白原血癥、高脂血癥和循環(huán)障礙等。血栓栓塞性疾病一旦發(fā)生危害嚴重，應以預防為主，要預防和治療血栓，需要長期保證血液的正常狀態(tài)。因此，研發(fā)作用緩和、無出血副反應、可長期安全使用的抗栓藥物就成為抗栓藥物研發(fā)的一個方向。
　　 類肝素是指天然的、合成的和半合成的與肝素有類似作用的物質(zhì)。

2、豬腸黏膜類肝素作用緩和、副作用小、療效肯定、費用較低，從分子量和化學性質(zhì)方面更適于口服，而服用方便的類肝素制劑是抗栓藥物重要的研發(fā)方向。目前，豬腸黏膜類肝素已經(jīng)被開發(fā)成預防和治療血栓的藥物（如danaparoid，lomoparan，sulodexide，mesoglycan等）在國外市場上市多年。然而，我國生產(chǎn)精品肝素而得到的副產(chǎn)物豬腸黏膜類肝素則被低價出售，沒有該類藥物上市，這種類肝素產(chǎn)量大、成本低，亟待開發(fā)和利用。在國內(nèi)開發(fā)新的、

3、更安全有效的豬腸黏膜類肝素抗栓藥物制劑，具有極大的實用價值，前景良好。
　　 豬腸黏膜類肝素(heparinoid，HPND)的主要組分是硫酸乙酰肝素(heparansulfate，HS)、硫酸皮膚素（dermatan sulfate，DS）、少量的肝素(heparin，HP)和極少量的硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，CS)。國內(nèi)外大量研究表明，豬腸黏膜類肝素的主要組分都具有抗血栓作用。HS和HP通過結(jié)合抗凝

4、血酶Ⅲ(antithrombinⅢ，ATⅢ)加速凝血酶和各凝血因子的失活速度；DS主要通過結(jié)合肝素輔因子Ⅱ(heparin cofactorⅡ，HCⅡ)抑制凝血酶活性，降低血小板聚集，而發(fā)揮抗血栓作用。在抗凝血過程中，有1/3的凝血酶是通過HCⅡ的結(jié)合而使活性受到抑制，另外2/3的凝血酶通過ATⅢ被抑制。并且，這兩種凝血酶抑制方式在體內(nèi)凝血過程中是分別獨立進行的。當DS和HS同時存在時，兩者起到協(xié)同增效作用。然而，這類藥物（如sulod

5、exide）的生物效價卻是用脂蛋白酯酶釋放活性(lipoprotein lipase release unit，LSU)來確定的。對該類藥物的制備方法、組分組成詳細信息、各組分對其生物效價影響的研究卻報道甚少。
　　 因此，本實驗以HP精制的副產(chǎn)物豬腸黏膜類肝素粗品為原料分離純化制備豬腸黏膜類肝素(HPND);以sulodexide(SLDX)作為陽性對照藥，對所制得的HPND用Benedict's沉淀法和強陰離子交換層析法分離

6、純化，得到各組分，并對其進行全面的結(jié)構(gòu)確證和理化性質(zhì)分析，包括雙糖分析、核磁圖譜分析、分子量測定、比旋光度分析、醋酸纖維素薄膜電泳分析、硫酸根/羧酸跟比值測定等；為了研究HPND的抗栓相關(guān)活性及其內(nèi)在機理，本實驗在體外檢測了其各組分的抗FXa活性和抗FⅡa活性，得到各組分的抗FXa/抗FⅡa活性比值：用體內(nèi)試驗驗證了HPND的促脂蛋白酯酶(LPL)釋放活性和促組織纖溶酶原激活劑(t-PA)釋放活性；為了進一步研究HPND的何種組分對促L

7、PL釋放活性和促t-PA釋放活性發(fā)揮主要作用，本實驗用體內(nèi)實驗分別進行了HS和DS促LPL釋放活性以及促t-PA釋放活性的協(xié)同作用研究。
　　 本研究取得的結(jié)果和結(jié)論有以下幾個方面：
　　 1．HPND的制備及其各組分的分離純化
　　 以粗品豬腸黏膜類肝素作為原料，經(jīng)過胰蛋白酶（trypsin）和木瓜蛋白酶(papain)聯(lián)用酶解，或鏈酶蛋白酶E(pronaseE)酶解，水解掉糖胺聚糖鏈上的雜蛋白，然后用CaCl

8、2沉淀法脫蛋白，最后將得到的無蛋白多糖用過氧化氫氧化脫色除雜質(zhì)，經(jīng)脫鹽后冷凍干燥得到純的HPND。用紫外全波長掃描檢測，HPND的核酸和蛋白吸收符合美國藥典對核酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)的要求。
　　 為了進一步的研究，HPND連同對照藥SLDX用Benedict試劑沉淀法分為兩大組分，DS組分和HS組分。DS和HS經(jīng)過SP強陽離子交換層析脫銅，得到無銅純品?；鹧嬖游辗止夤舛确y定原料、DS和HS銅含量分別為2.83ppm、35.1pp

9、m和18.4ppm。
　　 HS組分再經(jīng)過QFF強陰離子交換層析二次分離，得到HSO，HS1和HS2三種亞組分。HPND和對照藥SLDX的HS組分QFF強陰離子交換層析二次分離圖譜顯示，兩者相應HSO，HS1和HS2三種亞組分的出峰位置一致。
　　 2．HPND和SLDX各組分結(jié)構(gòu)確證和理化性質(zhì)
　　 (1)HPND-DS，-Mw為22，070 Da，主要雙糖組成為α-△UA-[1→3]-GaINAc，比旋光度為

10、-56°，硫酸根/羧酸根比值1.14±0.03，核磁圖譜1H在1.940ppm有GaINAc的甲基的特征化學位移，可確定為硫酸皮膚素。
　　 (2)SLDX-DS，-Mw為18，860 Da，主要雙糖組成為α-△UA-[1→3]-GaINAc，比旋光度為-51°，硫酸根/羧酸根比值1.45±0.09，核磁圖譜1H在1.939ppm有GaINAc的甲基的特征化學位移，可確定為硫酸皮膚素。
　　 (3)HPND-HSO，比旋

11、光度為接近0°，含有雙糖α-△UA-[1→4]-GlcNAc，蒽酮比色法測定其糖含量為(15.31±0.96)％，
　　 (4)SLDX-HSO，比旋光度為接近0°，含有雙糖α-△UA-[1→4]-GlcNAc，葸酮比色法測定其糖含量為(3.60±0.38)％，
　　 (5)HPND-HS1，-Mw為14，070 Da，主要雙糖組成為α-△UA-[1→4]-GlcNAc和α-△UA-2S-[1→4]-GlcN-6S，比旋

12、光度為57°，硫酸根/羧酸根比值1.06±0.06，為硫酸乙酰肝素；
　　 (6)SLDX-HS1，-Mw為11,150Da，主要雙糖組成為α-△UA-[1→4]-GlcNAc和α-△UA-2S-[1→4]-GlcN-6S，比旋光度為50°，硫酸根/羧酸根比值1.50±0.08，為硫酸乙酰肝素；
　　 (7)HPND-HS2，-Mw為14，300Da，主要雙糖組成為α-△UA-[1→4]-GlcNAc和α-△UA-2S-

13、[1→4]-GlcNS-6S，比旋光度為40°，硫酸根/羧酸根比值1.72±0.11，為肝素；
　　 (8)SLDX-HS2，-Mw為10,370Da，主要雙糖組成為α-△UA-[1→4]-GlcNAc和α-△UA-2S-[1→4]-GlcNS-6S，比旋光度為36°，硫酸根/羧酸根比值1.85±0.13，為肝素。
　　 3．HPND和SLDX各組分體外抗FXa活性和抗FⅡa活性
　　 HPND和SLDX各組分體

14、外抗FXa活性和抗FⅡa活性采用美國藥典方法測定，實驗結(jié)果顯示，HPND-DS、SLDX-DS、HPND-HSO和SLDX-HSO的抗FXa效價和抗FⅡa效價都比較低，都在2～8IU/mg之間，抗FXa/抗FⅡa比值均為1.2。HPND和SLDX的抗FXa活性和抗FⅡa活性都主要是由HS組分來呈現(xiàn)的：
　　 (1)HPND-HS抗FXa活性122.6 IU/mg，抗FⅡa活性97.7 IU/mg，抗FXa/抗FⅡa比值1.3;<

15、br>　　 (2)SLDX-HS抗FXa活性64.6 IU/mg，抗FⅡa活性46.9 IU/mg，抗FXa/抗FⅡa比值1.4;
　　 (3)HPND-HS1抗FXa活性19.6 IU/mg，抗FⅡa活性11.3 IU/mg，抗FXa/抗FⅡa比值1.7;
　　 (4)SLDX-HS1抗FXa活性8.6 IU/mg，抗FⅡa活性2.4 IU/mg，抗FXa/抗FⅡa比值3.6;
　　 (5)HPND-HS2抗

16、FXa活性173.6 IU/mg，抗FⅡa活性148.5 IU/mg，抗FXa/抗FⅡa比值1.2;
　　 (6)SLDX-HS2抗FXa活性118.4 IU/mg，抗FⅡa活性79.5 IU/mg，抗FXa/抗FⅡa比值1.5;
　　 4．HPND促血管內(nèi)皮細胞LPL和t-PA釋放活性
　　 健康wistar大鼠尾靜脈注射HPND，采用ELISA試劑盒測定大鼠血漿中LPL和t-PA含量變化情況，實驗組HPND給

17、藥的低、中、高劑量分別為2.5mg/kg、5.0mg/kg、10.0mg/kg;陽性對照SLDX組給藥劑量為5.0mg/kg;生理鹽水組做陰性對照。
　　 實驗結(jié)果顯示，HPND明顯促血管內(nèi)皮細胞LPL釋放，與SLDX效果相當，且具有劑量依賴性。具體數(shù)據(jù)為：生理鹽水組LPL含量為(0.0893±1.7069)ng/mL:HPND低、中、高劑量組LPL含量分別為(3.926±0.984)ng/mL、(9.502±1.532)ng/

18、mL、(10.481±4.681)ng/mL;SLDX組LPL含量為(10.368±4.453)ng/mL。
　　 HPND給藥之后大鼠血漿中t-PA含量隨著給藥劑量的增大微弱的升高，即HPND促t-PA釋放活性并不明顯。實驗結(jié)果如下：生理鹽水組t-PA含量為(0.4641±0.0421)pg/mL;HPND低、中、高劑量組t-PA含量分別為(0.5336±0.1564)pg/mL、(0.7051±0.1538)pg/mL、(0

19、.7771±0.1091)pg/mL;SLDX組t-PA含量為(0.5259±0.0595)pg/mL。
　　 5．HS和DS協(xié)同促LPL和t-PA釋放活性
　　 為了確定HPND中促LPL和t-PA釋放活性的主要組分，按HS和DS在HPND中的百分含量設(shè)立低、中、高劑量組分別驗證HS和DS促LPL和t-PA釋放活性。實驗結(jié)果表明，DS比HS具有更強的促LPL釋放能力，而DS和HS的促t-PA釋放能力都較弱，但是DS比H

20、S作用稍強。
　　 DS低、中、高劑量組LPL含量分別為(1.5355±0.8644)ng/mL、(2.0118±0.9767)ng/mL、(3.7870±2.2535)ng/mL;HS低、中、高劑量組LPL含量分別為(1.6134±0.4838)ng/mL、(2.5573±0.6038)ng/mL、(2.8604±0.8253)ng/mL;生理鹽水組(0.0893±1.7069)ng/mL。
　　 DS低、中、高劑量t

21、-PA含量分別為(0.6507±0.2116)pg/mL、(0.7429±0.2547)pg/mL、(0.7401±0.1543)pg/mL;HS低、中、高劑量t-PA含量分別為(0.5044±0.1049)pg/mL、(0.6297±0.2148)pg/mL、(0.5883±0.1786)pg/mL;生理鹽水組(0.4641±0.0421)pg/mL。
　　 6．本課題取得的主要成果
　　 (1)建立了一套實驗室制備豬