沖擊波與地塞米松誘導(dǎo)自體血清培養(yǎng)的hMSCs成骨分化的實(shí)驗研究.pdf

1、目的:人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)是從骨髓中分離得到的一種多潛能干細(xì)胞,具有自我更新和多向分化潛能,已證實(shí)這類細(xì)胞在合適的體內(nèi)外特定條件下可向成骨、軟骨、神經(jīng)、肌肉、皮膚和肝等多種類型的成熟細(xì)胞分化,因而是組織工程領(lǐng)域中的理想的種子細(xì)胞。但由于骨髓中hMSCs的數(shù)量有限,在進(jìn)行體內(nèi)移植前必須進(jìn)行體外擴(kuò)增。目前主要應(yīng)用胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)進(jìn)行

2、hMSCs的體外培養(yǎng),而胎牛血清本身可能傳染病毒、帶來異種免疫原,且存在排斥反應(yīng)的問題,這極大地阻礙了hMSCs在臨床上的應(yīng)用,而自體血清(autologous serum,AS)可避免上述問題。而對hMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)主要應(yīng)用傳統(tǒng)的地塞米松,但地塞米松濃度的差異對hMSCs的影響很大,濃度稍微增大,對細(xì)胞增殖有明顯抑制作用,并有向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的趨勢。體外沖擊波療法(extracorporeal shock waves thera

3、py,ESWT)因其能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖,近年來利用其治療股骨頭缺血性壞死、骨不連及骨折延遲愈合等取得了良好的療效。我們利用ESWT與地塞米松比較對AS培養(yǎng)的hMSCs進(jìn)行成骨分化。本研究國內(nèi)外均未見報道。本研究利用ESWT與地塞米松比較對AS培養(yǎng)的hMSCs進(jìn)行成骨分化,為臨床治療骨病探索一種新的治療方法,從而指導(dǎo)臨床治療。
　　 方法:
　　 1抽取分離hMSCs及獲取AS:選擇10名志愿者(排除代謝性疾病),每

4、名志愿者抽取骨髓60ml,用梯度離心法分離出hMSCs。抽取外周靜脈血100ml,然后分離出AS(約55ml)。
　　 2觀察AS對hMSCs增殖的影響:把每名志愿者的骨髓分成兩組,分別用10％AS和10％FBS對hMSCs進(jìn)行體外培養(yǎng),通過相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、檢測24小時細(xì)胞貼壁率、細(xì)胞倍增時間、CCK-8(cellcounting kit-8)測細(xì)胞增殖曲線、檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物、細(xì)胞周期及免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測比較兩組

5、hMSCs的增殖狀況。
　　 3比較ESWT與地塞米松對AS培養(yǎng)的hMSCs成骨分化的影響:把AS培養(yǎng)的hMSCs分成兩組,兩組分別用ESWT(0.36mj/mm2/100次)和傳統(tǒng)的誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)基(10nM地塞米松、50uM抗壞血酸、10mMβ-甘油磷酸鈉)分別對hMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo),對誘導(dǎo)好的細(xì)胞進(jìn)行ALP定量檢測、ALP染色、茜素紅染色及RT-PCR.測成骨基因(堿性磷酸酶、骨鈣素、骨橋蛋白、骨結(jié)合素、Ⅰ型膠原)表達(dá)比較

6、兩組成骨分化情況。對所有數(shù)據(jù)(x)±s表示統(tǒng)計學(xué)分析,設(shè)定P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1 hMSCs顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:AS和FBS培養(yǎng)的細(xì)胞在同一代次上形態(tài)無明顯差異,具有典型的hMSCs形態(tài),隨著代次的增加,部分細(xì)胞逐漸變扁,貼壁性減退,出現(xiàn)一些漂浮的細(xì)胞；部分分泌強(qiáng)的細(xì)胞分泌物增多,細(xì)胞增殖速度明顯下降,這種現(xiàn)象在7代以后尤為明顯。根據(jù)P3細(xì)胞計數(shù)結(jié)果計算24h貼附率,兩組組分別為:(94

7、.34±1.7)％、(93.0±1.6)％,(P>0.05),無顯著差異。根據(jù)P3細(xì)胞計數(shù)AS組細(xì)胞倍增時間(平均53小時,41.54h),FBS組(平均84小時,76-89h),P<0.01,有顯著性差異,AS組的細(xì)胞倍增時間明顯短于FBS組。CCK-8檢測根據(jù)每日檢測結(jié)果繪制細(xì)胞增殖曲線顯示兩組間差異非常顯著(P<0.01),AS培養(yǎng)的hMSCs增殖能力提高,峰值增高。AS在細(xì)胞增殖上明顯優(yōu)于FBS。
　　 2細(xì)胞表面分子測

8、定和免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測:流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示AS和FBS培養(yǎng)的細(xì)胞表面抗原CD44的表達(dá)陽性率分別為99.96％、99.30％,符合hMSCs的細(xì)胞表面特征,兩組沒有明顯差異。免疫熒光染色顯示兩組細(xì)胞CD44、CD105均呈陽性表達(dá),綠色、紅色熒光遍及胞質(zhì)。
　　 3 hMSCs細(xì)胞周期測定:結(jié)果顯示hMSCs具有干細(xì)胞的典型周期特性,大部分細(xì)胞處于G0/G1期,只有少數(shù)進(jìn)入S期。隨代次增加,處于G0/G1期的細(xì)胞的比例逐漸

9、減少,S期細(xì)胞比例逐漸增多,與形態(tài)及生長特性的變化規(guī)律相一致,反映了細(xì)胞衰老的進(jìn)程,兩組沒有明顯差異。
　　 4 ALP定量測定和ALP染色:結(jié)果顯示在各時間點(diǎn)ESWT組ALP活性明顯高于地塞米松誘導(dǎo)組,兩組都在第四天開始持續(xù)增加,在第14天達(dá)到峰值,繼而下降。兩組有明顯差異(P<0.05)。兩組同樣分別成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后,棄培養(yǎng)基,用PBS洗劑2次,用95％酒精固定10分鐘。按ALP試劑盒說明書進(jìn)行染色。結(jié)果顯示ESWT組A

10、LP染色強(qiáng)度明顯高于地塞米松誘導(dǎo)組。
　　 5茜素紅法鈣化結(jié)節(jié)染色:兩組同樣分別誘導(dǎo)28天后進(jìn)行茜素紅染色,兩組均可見礦化結(jié)節(jié)。100倍鏡下隨機(jī)選取3個視野進(jìn)行計數(shù),結(jié)果ESWT組礦化結(jié)節(jié)數(shù)為7.5±1.2,地塞米松誘導(dǎo)組礦化節(jié)數(shù)為5.0±0.8,ESWT組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯多于地塞米松誘導(dǎo)組。
　　 6 RT-PCR檢測成骨基因表達(dá):兩組同樣分別成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)28天后檢測:堿性磷酸酶(alkaline phosphatase

11、,ALP)、骨鈣素(osteocalcin,OC),骨橋蛋白(osteopontin,OP),骨結(jié)合素(osteonectin,ON),Ⅰ型膠原(collagenⅠ,ColⅠ),GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)表達(dá)情況。成骨誘導(dǎo)28天后,沖擊波干預(yù)組中的ALP、ON、OP、OC、ColⅠ的基因表達(dá)明顯高于地塞米松誘導(dǎo)組。
　　 結(jié)論:
　　 1、自體血清與胎牛血