鈣結(jié)合蛋白S100A6在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及功能研究.pdf

1、目的:在所有的泌尿系統(tǒng)腫瘤中,腎癌的發(fā)生率和死亡率為第二位。腎透明細(xì)胞癌是腎細(xì)胞癌中最常見的病理類型,對放化療不敏感,非轉(zhuǎn)移腎透明細(xì)胞癌手術(shù)切除后仍有一部分發(fā)生轉(zhuǎn)移,缺乏有效的預(yù)測指標(biāo)及治療靶點。鈣結(jié)合蛋白S100A6是S100蛋白家族中的一員,參與多種細(xì)胞生物學(xué)調(diào)節(jié)機制,包括細(xì)胞的增殖、分化、周期、細(xì)胞骨架形成等。近年來越來越多研究發(fā)現(xiàn)S100A6表達(dá)水平及其活性變化與腫瘤的發(fā)生和惡性進(jìn)展密切相關(guān),并且能夠判斷腫瘤的預(yù)后。有研究發(fā)現(xiàn)S

2、100A6在胰腺癌,結(jié)腸癌、甲狀腺癌、黑色素瘤等不同類型腫瘤中的表達(dá)升高。S100蛋白家族在腎透明細(xì)胞癌中有報道是升高的,但在目前的研究和報道中,沒有見到S100A6在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及功能研究。本實驗主要研究S100A6在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá),包括非轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá),同時結(jié)合臨床病理資料與S100A6的mRNA相對表達(dá)量通過單因素和多因素的比較進(jìn)行相關(guān)性分析,在其功能學(xué)方面,我們通過構(gòu)建786-O和Ca

3、ki-1的腎透明細(xì)胞癌的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,進(jìn)行了相關(guān)的體內(nèi)和體外實驗,發(fā)現(xiàn)S100A6能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生的增殖和侵襲,從而促進(jìn)S100A6對腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展。
　　方法:①在信使RNA的水平以及蛋白水平和組織水平檢測129對非轉(zhuǎn)移腎透明細(xì)胞癌組織和58例轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌的表達(dá)。并采用單因素和多因素的相關(guān)性分析以及結(jié)合術(shù)后隨訪資料進(jìn)行生存分析,發(fā)現(xiàn)了S100A6的mRNA表達(dá)水平在腫瘤和轉(zhuǎn)移組織表達(dá),并且與臨床病理特點結(jié)合分析

4、及預(yù)后的相關(guān)性;②通過real-time PCR和western-blot方法檢測正常腎小管上皮細(xì)胞株HKC,HK-2,非轉(zhuǎn)移性人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株786-O,769-P和Caki-2,以及轉(zhuǎn)移性人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株ACHN,Caki-1,SN12-PM6中S100A6的表達(dá),使用第三代病毒系統(tǒng)穩(wěn)定分別轉(zhuǎn)染腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株786-O和Caki-1,構(gòu)建S100A6的過表達(dá)和敲除的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,實驗組和對照組的周期和增殖能力通過MTS

5、和流失細(xì)胞儀的方法檢測。并通過裸鼠成瘤實驗判斷S100A6在體內(nèi)對腫瘤的影響;③通過流式細(xì)胞儀檢查S100A6敲除和過表達(dá)對于細(xì)胞凋亡的影響,并進(jìn)行細(xì)胞的芯片檢測進(jìn)一步尋找S100A6變化后下游的差異基因;通過劃痕實驗及transwell方法檢測過表達(dá)和敲除了S100A6的786-O和Caki-1細(xì)胞株的遷移和侵襲能力的變化;④分析通過129例腎透明細(xì)胞癌腫瘤組織中S100A6的信使RNA的表達(dá)量,對其臨床病理資料進(jìn)行匹配分析S100A

6、6表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性,并結(jié)合患者術(shù)后的隨訪進(jìn)行生存分析,分別以死亡和轉(zhuǎn)移兩個事件為結(jié)果進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:①S100A6的mRNA水平在轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌手術(shù)標(biāo)本和細(xì)胞株中表達(dá)明顯升高,在正常腎組織和細(xì)胞株中表達(dá)很低。mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)方向一致,同時發(fā)現(xiàn),S100A6的mRNA的表達(dá)與年齡、性別、體重指數(shù)無關(guān),與組織學(xué)分級、臨床分期和腫瘤大小相關(guān)有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)。②在兩株腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系786-O

7、和Caki-1中穩(wěn)定過表達(dá)和敲除S100A6后,進(jìn)行MTS和裸鼠成瘤實驗,S100A6敲除后明顯抑制腎透明細(xì)胞癌腫瘤的增殖,體內(nèi)和體外多個實驗均證明S100A6敲除后的腫瘤細(xì)胞增殖減慢,成瘤體積小、重量輕。在S100A6敲除后會影響腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控,細(xì)胞被阻滯在G2/M期。對穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測凋亡后發(fā)現(xiàn),S100A6敲除后細(xì)胞發(fā)生了顯著凋亡。③由于發(fā)現(xiàn)了S100A6在腎透明細(xì)胞癌中的抑制凋亡的作用,我們進(jìn)行細(xì)胞的芯片檢測進(jìn)行確定

8、S100A6變化作引起的下游的差異靶基因篩查,對于基因芯片的分析和預(yù)測結(jié)果顯示 S100A6與趨化因子家族,尤其是CXCL14關(guān)系緊密,可能就是引起細(xì)胞凋亡的因素。同時還發(fā)現(xiàn)S100A6的差異靶基因中有多個與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,提示S100A6還可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。④對病理資料及臨床隨訪資料進(jìn)行相關(guān)性分析,顯示在腎透明細(xì)胞癌組織中S100A6的 mRNA水平(△CT值)與病理組織學(xué)分級、腫瘤大小、臨床分期呈正相關(guān);通過多元回歸分析發(fā)

9、現(xiàn)S100A6的mRNA水平(△CT值)和腫瘤大小是腫瘤轉(zhuǎn)移的獨立危險因素;進(jìn)一步的生存分析發(fā)現(xiàn),S100A6的mRNA水平高(△CT值)的一組,患者術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移的幾率大。
　　結(jié)論:①鈣結(jié)合蛋白S100A6異常高表達(dá)可能與腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生和惡性進(jìn)展有關(guān);②敲除S100A6后,細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖;同時S100A6的存在抑制的可能有CXCL1介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡,同時S100A6敲除后腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株