在脂多糖誘導(dǎo)的血腦屏障破壞中p38MAPK、JNK信號通路與基質(zhì)金屬蛋白酶作用機制的研究.pdf

1、本文主要從以下兩方面進行論述：
　　第一部分 在脂多糖誘導(dǎo)的血腦屏障破壞中p38MAPK、JNK信號通路的作用機制研究
　　目的:探討p38MAPK和c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)血腦屏障(blood-brain barrier， BBB)的破壞中的作用。
　　方法:1.培養(yǎng)人腦微血管內(nèi)皮細胞(human cerebral microvascular

2、 endothelial cells，hCMEC/D3)，用不同濃度的LPS、p38MAPK和JNK信號通路抑制劑（分別為SB203580、SP600125）分別刺激細胞24h，用四甲基偶氮唑鹽(MTT法)檢測其對細胞活力的影響。
　　2.用不同濃度的LPS刺激細胞，蛋白免疫印跡法(Western blot法)檢測緊密連接蛋白Occludin、ZO-1的變化。
　　3.用LPS刺激細胞不同的時間后，用蛋白免疫印跡法檢測p38

3、MAPK及JNK信號通路磷酸化水平的變化。
　　4.用SB203580、 SP600125預(yù)處理細胞1h后，再加入LPS共培養(yǎng)24h，分別用Western blot法及熒光定量PCR法(RT-PCR)檢測緊密連接Occludin、ZO-1蛋白及其mRNA表達的變化。
　　結(jié)果:1.LPS、SB203580和SP600125濃度分別在10μg/ml、7.69μg/ml和0.22μg/ml以下時對hCMEC/D3細胞活力無明顯影

4、響。
　　2.LPS刺激細胞可誘導(dǎo)緊密連接Occludin、ZO-1蛋白及其mRNA的表達水平顯著下調(diào)，Western blot法進一步證實LPS刺激細胞后p38MAPK和JNK信號通路分子的磷酸化顯著增加。
　　3.SB203580或SP600125預(yù)處理細胞1h，可以顯著上調(diào)LPS誘導(dǎo)的Occludin蛋白及其mRNA的表達水平，但對LPS誘導(dǎo)的ZO-1蛋白及mRNA表達的影響無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:LPS可誘導(dǎo)

5、緊密連接Occludin、ZO-1蛋白及其mRNA的下調(diào)導(dǎo)致BBB破壞;LPS可能通過激活p38MAPK和JNK信號通路磷酸化，從而調(diào)節(jié)hCMEC/D3細胞緊密連接Occludin蛋白及其mRNA的表達;然而LPS對ZO-1蛋白及其mRNA表達的影響可能通過其他信號通路實現(xiàn)。
　　第二部分 在脂多糖誘導(dǎo)的血腦屏障破壞中基質(zhì)金屬蛋白酶的作用及其信號通路機制的研究
　　目的:探討基質(zhì)金屬蛋白酶-2和-9（MMP-2和MMP-9）

6、在LPS誘導(dǎo)BBB破壞中的作用及其信號通路機制。
　　方法:1.培養(yǎng)hCMEC/D3，用p38MAPK和JNK信號通路抑制劑預(yù)處理細胞1h，再與LPS共培養(yǎng)24h，分別用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和RT-PCR法分別檢測MMP-2活性和MMP-9 mRNA表達的變化。
　　2.用MMPs總抑制劑、MMP-2及MMP-9抑制劑（分別為Doxycyclinehyclme、SB-3CT13.9 nmol/l及SB-3CT600

7、nmol/L）分別預(yù)處理細胞1h后，再與LPS共培養(yǎng)，Western blot法檢測Occludin蛋白表達的變化。
　　結(jié)果:1.LPS刺激細胞后可觀察到MMP-2活性和MMP-9 mRNA的過度表達，p38MAPK和JNK信號通路抑制劑預(yù)處理后可顯著下調(diào)LPS的誘導(dǎo)作用。
　　2.LPS刺激細胞后緊密連接Occludin表達顯著下降，MMPs總抑制劑、MMP-2及MMP-9抑制劑預(yù)處理后可明顯逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的緊密連接Oc